■ 李 洁 张孟阳 郭 宏 黄 娟 王德培，3*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.天津牧丰饲料有限公司，天津300380；3.工业微生物教育部重点实验室，天津300457）

发酵液体饲料（Fermented liquid feed，FLF）是指在 人工控制条件下，料水比按1∶1.5～1∶4的比例混合，通过微生物自身的代谢活动，经过足够长时间的发酵后，形成一种低pH值、状态稳定、易被畜禽采食、消化、吸收的饲料[1-2]。较干料和液体饲料，发酵液体饲料具有许多优点：①适口性好，易消化；②饲料原料来源广泛，如食品工业副产物，降低生产成本；③符合猪的消化生理特点；④微生物某些代谢产物可消除饲料中的抗影响因子，可减少抗生素的使用；⑤降低肠道pH值，抑制有害菌繁殖，提高肠道健康等[3-4]。李永明等[5]研究发现，与对照组相比，饲喂发酵谷物液体料组平均日采食量提高22.63%，丰富肠道微生物菌群多样性，进而改善仔猪生长性能。陈鲜鑫等[6]用30.88 kg左右的杜×长×大三元杂交生长猪进行饲喂试验，结果表明，饲喂发酵液体饲料组与对照组相比日增重提高34.03%、采食量提高12.55%、料肉比降低15.84%，饲喂发酵液体饲料组与未发酵液体饲料组相比日增重提高16.86%、采食量降低6.44%、料肉比降低19.83%。杨建松等[7]对仔猪饲料发酵工艺优化后，还原糖含量、酸溶蛋白质含量和乳酸含量分别增加了1.23%、1.75%和3.3%，同时含有大量益生菌，有效抑制大肠杆菌。发酵液体饲料的品质受诸多因素的影响，包括发酵菌种、温度、时间、料水比和日粮组成等。Nuria Canibe等[8]研究显示，使用3种含有不同乙酸浓度的FLF日粮饲喂仔猪，结果显示，高乙酸浓度的FLF略微降低饲料的pH值，在不影响体增重的情况下，降低仔猪的饲料采食量。C.Pedersen等[9]研究液体发酵饲料对生长育肥猪的影响，结果发现干料与水1∶3混合饲料与单纯干料相比，有降低日粮GE、DM和CP的回肠消化率的趋势。在发酵过程中，芽孢菌和乳酸菌能产生多种益生素，能有效抑制肠道有害菌的生长，维持肠道健康，如郭红炳等[10]试验结果表明，在断奶仔猪饲料中使用益生素，可大幅降低饲料中抗生素的用量，并有减少仔猪腹泻、提高增重的趋势。本文以枯草芽孢杆菌和乳酸菌发酵仔猪全价液态饲料进行研究，并通过仔猪饲喂试验探究发酵液体饲料对仔猪生长的影响。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

枯草芽孢杆菌WL-BA-1（Bacillus subtilis WLBA-1）、枯草芽孢杆菌B10-5（Bacillus subtilis B10-5）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、粪肠球菌LJ(Enterococcus faecalis LJ)，均由本实验室保藏。

1.2 培养基

LB培养基（g/l）：蛋白胨10、酵母粉10、NaCl 5，pH值7.5。

淀粉培养基（g/l）：牛肉膏5、蛋白胨5、NaCl 5、可溶性淀粉20、琼脂18，pH值7.2。

MRS培养基（g/l）：蛋白胨 10、牛肉粉5、葡萄糖20、酵母粉4、乙酸钠5、磷酸氢二钾2、硫酸镁0.2、柠檬酸三铵2、硫酸锰0.05、吐温80 1，pH值6.2。

麦康凯琼脂培养基(g/l)：蛋白胨20、乳糖10、牛胆盐5、NaCl 5、中性红0.03、琼脂18，pH值7.0。

1.3 饲料原料

试验所用饲料原料由天津牧丰饲料有限公司提供，将料水重量体积比1∶3.5混合，糊化前经检测其还原糖含量为0.19%，乳酸、乳酸菌数均检测不出。

1.4 饲料液体发酵

将饲料与水按一定比例混合后，装入发酵瓶中，置于100℃灭菌锅中糊化20 min，冷却到室温后接入相关菌株种子液，混匀后置于恒温培养箱中发酵。

1.5 测定方法

1.5.1 还原糖含量的测定[11]

采用DNS法测定发酵饲料中还原糖的含量。

1.5.2 乳酸含量的测定

称取发酵饲料5.00 g置于装有45 ml蒸馏水的250 ml三角瓶里，充分摇匀并浸提1 h，之后离心取上清液，稀释相应倍数后用SBA-40 E型生物传感分析仪测其中乳酸含量。

1.5.3 活菌数的测定[12]

乳酸菌用MRS固体培养基作为计数培养基，42℃厌氧培养48 h计数；芽孢杆菌用淀粉培养基作为计数培养基进行计数，30℃静置培养24 h计数；大肠杆菌用麦康凯培养基作为计数培养基，37℃静置养24 h计数。

1.6 发酵条件的单因素优化

在前期预试验中，发酵液体饲料中芽孢菌与乳酸菌比例为1∶1，两株芽孢菌接种比例为1∶1，两株乳酸菌接种比例为1∶1，饲料与水比例(W/V)为1∶4，总接种量为8%，发酵后液体饲料具有酸甜香味，在此基础上对各因素进行优化。

1.6.1 芽孢菌与乳酸菌接种比例的确定

选取芽孢菌与乳酸菌接种比例分别为1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1这5个水平进行发酵试验。

1.6.2 两株芽孢菌比例的优化

选取两株芽孢菌比例分别为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3这5个水平进行发酵试验。

1.6.3 两株乳酸菌比例的优化

选取两株乳酸菌比例分别为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3这5个水平进行发酵试验。

1.6.4 总接种量的确定

选取总接种量分别为4%、6%、8%、10%、12%这5个水平进行发酵试验。

1.6.5 料水比的确定

选取料水比分别为1∶3，1∶3.5，1∶4，1∶4.5，1∶5这5个水平进行发酵试验。

1.6.6 发酵条件的正交试验

在单因素试验的基础上，选取影响显著的因素进行正交试验。采用L9(34)型三水平三因素正交表，以芽孢菌与乳酸菌接种比例、总接种量、料水比3个因素作为考察因素，研究对发酵结果的影响。

1.7 发酵温度的确定

选取温度分别为20、26、32、37、42 ℃这5个水平进行分析，20、26℃发酵5 d，32、37℃和42℃发酵3 d。

1.8 仔猪饲喂试验

1.8.1 试验动物与日粮

微生物发酵仔猪全价饲料，饲喂7日龄～35日龄仔猪，共24只，分两个处理组，每个处理组三个重复，对照组饲喂全价粉料，试验组微生物发酵仔猪液态饲料替代50%全价粉料。试验基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)

1.8.2 饲养管理

试验仔猪断奶后立即转入保育舍，圈舍均为高床平养，保持舍内通风顺畅。试验组每天定时饲喂4次，喂料时根据上次喂料采食情况，适当增减给料量，使仔猪保持自由采食状态。乳头式饮水器饮水，猪舍温度控制在25～30℃，每天打扫2次猪舍。其他日常管理按常规进行。

1.8.3 测定指标

详细记录每天圈舍的温湿度和采食饮水状况等变化。观察每天仔猪粪便变化、健康状况。试验初、中和末期称重，计算耗料。计算平均日耗料、料肉比、日增重、腹泻率等。

2 结果与分析

2.1 发酵液体饲料芽孢菌与乳酸菌接种比例的优化

发酵液体饲料中两株芽孢菌接种比例为1∶1，两株乳酸菌接种比例为1∶1，饲料与水比例(W/V)为1∶4，总接种量为8%，芽孢菌与乳酸菌比例见表2。

由表2可以看出，芽孢菌与乳酸菌接种比例对发酵液pH值和发酵后乳酸和还原糖含量影响相对较小，且pH值＜4.0，有效抑制有害菌的生长，芽孢菌与乳酸菌接种比例为2∶1时，还原糖含量最高，且乳酸含量、芽孢菌数和乳酸菌数也有较高的水平，所以确定发酵液体饲料中芽孢菌与乳酸菌比例为2∶1。

表2 芽孢菌与乳酸菌接种比例对发酵液体饲料的影响

2.2 发酵液体饲料两株芽孢菌比例的优化

发酵液体饲料中芽孢菌与乳酸菌接种比例为2∶1，饲料与水比例(W/V)为1∶4，接种量为8%，两株乳酸菌接种比例为1∶1，两株芽孢菌比例如表3。

表3 两株芽孢菌混合比例对发酵液体饲料的影响

由表3可看出，两株芽孢菌的比例对乳酸和及益生菌数影响较小，而对发酵产生还原糖含量影响明显，当两株芽孢菌比例为1∶1时，还原糖含量最高，所以确定发酵液体饲料中两株芽孢菌WL-BA-1和B10-5的比例为1∶1。

2.3 发酵液体饲料两株乳酸菌比例的优化

发酵液体饲料中芽孢菌与乳酸菌接种比例为2∶1，接种量为8%，两株芽孢菌比例为1∶1，两株乳酸菌比例如表4。

从表4可以看出，两株乳酸菌的比例为1∶2时，还原糖含量最高，益生菌总数也处于较高水平，从而确定发酵液体饲料中两株凝结芽孢杆菌和粪肠球菌LJ的比例为1∶2。

2.4 发酵液体饲料总接种量的优化

发酵液体饲料中芽孢菌与乳酸菌接种比例为2∶1，两株芽孢菌比例为1∶1，两株乳酸菌比例分别为1∶2，接种量如表5。

由表5可以看出，随着接种量的增加，接种量对还原糖含量影响不明显，对乳酸含量影响也不显著，但接种量高，生产上所需的菌液也高，成本也随之增加，而4%接种量还原糖和乳酸含量以及益生菌数都处于一个较高的水平，所以最终确定接种量为4%。

表4 两株乳酸菌比例对发酵液体饲料的影响

表5 总接种量对发酵液体饲料的影响

2.5 发酵液体饲料料水比的优化

发酵液体饲料中芽孢菌与乳酸菌接种比例为2∶1，接种量为4%，两株芽孢菌比例为1∶1，两株乳酸菌比例为1∶2，饲料与水比例(W/V)如表6。

表6 料水比对发酵液体饲料的影响

液体饲料能提高猪的生长性能，饲料的含水量有助于饲料中营养成分的吸收利用，同时影响液体发酵的质量。研究报道，料水比达到1∶3或1∶3.5时能提高生长效率和饲料利用率。由表6可知，随着水分的提高，对发酵产乳酸和活菌数没有明显影响，而对发酵产生还原糖影响较大呈先增大后减少，料水比1∶3.5时达到最大值，所以确定料水比为1∶3.5。

2.6 发酵条件的正交试验

以单因素优化的发酵条件，采用L9(34)型三水平三因素正交试验研究接种量、芽孢菌与乳酸菌的接种比例、料水比对发酵结果的影响，以还原糖含量作为指标进行分析，如表7和表8所示。

通过正交试验中各组发酵产生的还原糖进行分析可以看出各因素无显著性影响，各因子的主次顺序为：接种量＞料水比＞接种比例，即优化后的条件是接种量为4%，芽孢菌与乳酸菌接种比例为1∶1，料水比为1∶3.5。正交试验中第4组既是这个组合，其还原糖含量可达到2.12%，乳酸含量3.2%，芽孢菌数为1.3×106CFU/g，乳酸菌数为1.7×1010CFU/g，并且有效抑制了大肠杆菌，最终确定发酵条件。

表7 正交试验极差分析

表8 正交试验方差分析

2.7 发酵液体饲料温度的优化

以优化后的最佳条件接种发酵，进行发酵温度的确定，如表9。

表9 温度对发酵液体饲料的影响

从表9可看出，随着温度的升高，还原糖含量先增加后减小，37℃达到最高。其原因可能在于35℃左右芽孢菌代谢活跃，产生了淀粉酶、纤维素酶等，将饲料中的大分子物质降解成小分子物质，而温度过高，加上饲料发酵过程中产热，将会影响芽孢菌的生长以及代谢物的产生。在实际生产中，严格控制发酵温度难以实现，应根据季节变化改变发酵时间，通过表中数据可知，在32～37℃间发酵都可以实现一个较好的效果。

2.8 发酵饲料对仔猪生长的影响

由表10可看出，各组猪初始体重、日采食量、料肉比无显著性差异。与对照组相比，试验组平均日增重提高11.68%（P＜0.05），平均日采食量提高1.96%（P＞0.05），料肉比降低8.55%（P＞0.05），腹泻率下降54.88%。由于试验仔猪为7日龄～35日龄，每天的采食量较少，加上正在开胃阶段，所以试验组的平均日采食量的提高不明显，与许多研究有差距。由表11可以看出，发酵后饲料中有机酸以乳酸为主，含有少量的柠檬酸、丙酸和乙酸，使饲料中含有轻微酸甜香味。Van Winsen等（2011）[13]认为，发酵液体饲料的理想特性是：pH值＜4.5；乳酸菌菌数＞9 logCFU/ml；乳酸浓度＞150 mmol/l；乙酸浓度＜40 mmol/l；乙醇浓度＜0.8 mmol/l，本试验发酵后饲料品质基本与Van Winsen阐述的一致。表12可知，试验组粪便中乳酸菌数是对照组的80倍，而对照组粪便中大肠菌数是试验组的9倍，腹泻率是试验组的2.2倍，说明饲用发酵液体饲料增加了肠道乳酸菌，改变了肠道内菌群结构。以上说明发酵液体饲料能提高仔猪生长性能，改善肠道健康，从而保证仔猪健康。

表10 发酵饲料对仔猪生长性能的影响

表11 发酵饲料发酵3 d后有机酸的含量

表12 发酵饲料对仔猪粪便中微生物的影响

3 讨论

3.1 发酵液体饲料前后营养品质的变化

发酵饲料的品质直接影响了仔猪的适口性，而影响液体发酵饲料的因素主要包括菌种、接种量、接种比例、温度和料水比等。本试验选用乳酸菌和芽孢杆菌作为发酵菌种，芽孢杆菌在发酵过程中消耗了氧气，产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，将饲料中大分子物质降解成小分子物质，不仅有利于乳酸菌的生长，而且提高了饲料适口性，提高动物消化率；乳酸菌发酵过程中产生乳酸，降低pH值，抑制饲料中杂菌的生长，在肠道中还可抑制致病菌的繁殖。发酵前，饲料中含大量杂菌，还原糖、粗蛋白等含量较低，有益菌几乎没有，本试验发酵后益生乳酸菌＞1010CFU/g，还原糖和乳酸含量分别达到2.17%和3.4%，含有少量柠檬酸和丙酸，从而饲料具有酸甜香味，大大提高仔猪适口性。李龙等[14]对复合益生菌发酵饲料工艺进行优化后，结果发酵饲料品质为金黄色、芳香味、质地良好、pH值为4.27，游离氨基酸/总氮为13.73%，总菌数为5.50×108CFU/g，乳酸菌数和乳酸含量分别为16.17×108CFU/g和4.86 g/kg。张翠绵等[15]在最佳发酵条件下发酵高纤维固体饲料，结果显示固体饲料中面包酵母菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的活菌数分别为5.67×107、1.31×109、8.06×108CFU/g，酸香味浓郁，适口性强。

3.2 发酵液体饲料对仔猪生长的影响

饲料在发酵过程中，不仅产生一些有益物质，还能减少或消除抗营养因子，将植物蛋白降解成小肽、寡肽和游离氨基酸，很容易被小肠消化吸收。发酵液体饲料与母乳形态相似，减少断奶综合征对仔猪的影响。本试验以优化的最佳条件发酵后，将发酵料替代50%的仔猪全价粉料进行饲喂试验，试验组比对照组的平均日增重和日采食量都有所提高，腹泻率下降，说明发酵饲料改善了仔猪的适口性，提高消化率和转化率，并改善肠道健康。李小燕等（2013）研究结果表明，饲喂发酵液体饲料组与颗粒料组和粉料组相比，平均日增重分别提高9.39%和11.39%，料重比降低7.34%和8.53%，有效提高肠胃中乳酸菌含量，降低大肠杆菌含量，并有效提高仔猪生长性能。

4 结论

本文通过单因素试验和正交试验确定仔猪发酵液体饲料的发酵工艺为：接种量为4%，芽孢菌与乳酸菌接种比例为1∶1，料水比为1∶3.5，发酵温度32～37℃范围均可。按此条件37℃下发酵3 d后还原糖含量2.17%，乳酸含量3.4%，柠檬酸含量0.331%，丙酸含量0.130%，同时乳酸菌数达到1010CFU/g以上，大肠杆菌未检出。添加50%发酵液态饲料饲喂仔猪，发现与对照组相比，试验组平均日增重提高11.68%（P＜0.05），平均日采食量提高1.96%（P＞0.05），料肉比降低8.55%（P＞0.05），腹泻率下降54.88%。