张冬星 ， 康元环 ， 李温明 ， 张海月 ， 毕建飞 ， 单晓枫 ， 钱爱东 ， 田佳鑫

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ； 2.铁岭出入境检验检疫局 ， 辽宁铁岭112000)

八味中草药对维氏气单胞菌TH0426生物膜形成的影响

张冬星1， 康元环1， 李温明2， 张海月1， 毕建飞1， 单晓枫1， 钱爱东1， 田佳鑫1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118 ； 2.铁岭出入境检验检疫局 ， 辽宁铁岭112000)

为了解中药对维氏气单胞菌 (Aerornomasveronii, AV)TH0426株生物膜形成的影响。采用微孔板半定量法，研究五倍子、红花、黄连、鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴及黄芩8味中药水煎液对AV TH0426株生物膜的影响。结果显示，低浓度五倍子、红花和黄连水煎液对菌株生长及生物膜形成均无明显影响；而高浓度五倍子和黄连水煎液可通过抑制菌株的生长来影响生物膜的形成，高浓度红花水煎液对生物膜抑制作用明显，且不影响菌株的正常生长；其余五味中药鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴和黄芩对菌株的生长及生物膜形成无明显影响。表明高浓度五倍子、红花及黄连水煎液能抑制AV TH0426株生物膜的形成，具有抗AV TH0426株生物膜的作用，这将为从抗生物膜角度防治维氏气单胞菌提供有益参考。

五倍子 ； 红花 ； 维氏气单胞菌 ； 生物膜

维氏气单胞菌(Aerornonasveronii，AV)又称凡隆气单胞菌、维罗纳气单胞菌[1]，该菌隶属于气单胞菌科，气单胞菌属，且广泛存在于自然界水域、土壤和水生动物体内,可引起鲫、鲤、鳗及鲟鱼等多种鱼类发病[2-4]，对水产养殖业造成严重的经济损失。生物膜(biofilm, BF)被视为一种生物屏障，是由细菌通过胞外多糖复合物或纤毛共同作用粘附在生物材料或人体组织表面,不断分裂繁殖,并分泌大量胞外多糖复合物而共同形成的，由于BF内细菌代谢缓慢，使其对抗生素敏感性较低甚至阻滞抗生素分子进入BF[5]，这使得BF清除十分困难，常致顽固性感染。我国传统中药具有抗病菌、抗病毒及提高免疫力等作用,克服了化学药物和抗生素类药物的缺陷, 同时, 中草药还具有无残留、不易产生耐药性、能增强水产养殖动物免疫力等优点[6]。因此，本研究利用微孔板半定量法，检测五倍子及红花等八味中药水煎液对维氏气单胞菌生物膜形成的影响，探讨不同中药对生物膜形成的影响，为从抗生物膜形成角度防治维氏气单胞菌提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 菌种及中草药的选取 黄颡鱼源维氏气单胞菌(AV)TH0426菌株由浙江省淡水水产研究所徐洋助理研究员惠赠。通过本实验室前期对单味中药的初筛，本试验选取了抑菌效果明显的五倍子、红花、黄连、鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴和黄芩中草药，均购自长春中医药大学附属医院。

1.2 仪器设备与试剂耗材 96孔细胞培养板，酶标仪，恒温培养箱，粉碎机，电磁炉，烘箱，超净工作台，无水乙醇，高压蒸汽锅，胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，0.5%结晶紫溶液，0.85%生理盐水，RS琼脂培养基等。

1.3 植物水煎液的制备 根据任晓镤等[7]中药处理方法，将中草药进行打碎处理，使其成为直径约1 mm大小的颗粒，进行水煎处理，称取100 g粉末至瓷量杯中，并加入一定量的双蒸水(水浸过药面2-3 cm)，浸泡30 min，大火煮开，文火熬20 min，纱布过滤药液，滤渣再进行同样处理，合并2次药液，115℃高压灭菌15 min，4℃保存备用。

1.4 菌液制备 取100 μL AV TH0426 (-70℃冷冻菌液)于5 mL TSB中，在30 ℃的摇箱中摇16 h后，在RS琼脂培养基上活化，挑取单菌落，接种到5 mL TSB中置于30 ℃振摇24 h；取培养后的菌液0.5 mL，均匀涂抹普通琼脂平板上，30 ℃ 培养24 h；取灭菌生理盐水与培养板内，用灭菌的棉签轻轻洗下平板上的菌苔，加入灭菌生理盐水至10 mL，与麦氏比浊管比浊，细菌数稀释约1×105CFU/mL。

1.5 抑菌试验 取活化的菌液在固体培养基上涂抹100 μL，用打孔器在平板上打4个孔，将其在酒精灯上微微加热后置于4 ℃冰箱中30 min，并在打好的孔内加入50 μL药液，再置于30 ℃条件下培养24 h，记录抑菌圈的大小。抑菌效果按照《中药药理学》中的标准判定，即：抑菌直径大于20 mm为极度敏感；15～19 mm为高度敏感；10～14 mm为中度敏感；7～10 mm为低度敏感；7 mm以下为无作用。

1.6 八味中药MIC的测定 准备活化好的菌液，并采用两倍稀释方法测定药物对供试菌MIC[8]。即取无菌试管10支，在每支试管内加入1 mL的TSB培养液。吸取1 mL的药液(1 g /mL)入第1支试管，混匀，再吸取1 mL 到第2支试管，逐一进行到第9支管，弃去所吸取的1 mL 混合液，第10支为药物空白对照。之后在每支试管内依次加入1 mL稀释至1×105CFU/mL菌液，30 ℃培养24 h；取出试管进行观察，找出出现菌液清亮的最低药物浓度，即为该药物的最小抑菌浓度 (MIC) 值。

1.7 生物膜试验 根据参考文献[9]，采用改良的微量板半定量法进行检测。按照1∶100比例接种对数期生长的菌液至TSB液体培养基中(此时加入不同浓度的中草药水煎液，将培养液与水煎液混合均匀再上样至96孔板中)，混匀， 再吸取200 μL混合液于96孔板中，每个浓度中草药液处理8孔，同时设空白对照组，阳性对照组，阴性对照组及不加菌液的中草药药液对照组。30 ℃培养24 h，取出后测定菌株生长浊度D630值，吸出菌液，无菌生理盐水洗涤4次，56 ℃烘干固定1 h，0.5%结晶紫溶液染色 5 min，流水冲去染液，室温晾干后测定D490值。将所得数据进行处理分析。每个试验在不同的时间进行，重复3次。

1.8 不同浓度中药水煎液对菌株生物膜形成的影响 将8味中药浓度梯度设置为：0%、1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%与40%，按1.7方法分别测定生物膜形成。

1.9 统计学分析 试验结果采用 SPSS 16.0 统计软件检验。试验重复3次，每个药物浓度均设8个复孔，取平均值。

2 结果与分析

2.1 八味中药对AV TH0426抑菌圈直径测定 五倍子、红花、黄连、鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴、黄芩8味中药对AV TH0426的抑菌圈直径分别为12.33、13.67、13.33、14.33、13.33、10.67、 13.00、8.67 mm。五倍子、红花、黄连、鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴对试验菌株有较强抑制作用。

2.2 8味中药对AV TH0426 MIC的测定 五倍子、红花、黄连、鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴、黄芩8味中药对AV TH0426的MIC分别为31.25、15.63和31.25、62.50、7.81、31.25、15.63、125.00 mg/mL。红花、姜厚朴、地榆对试验菌株的抑菌作用较强。

图1 不同浓度地榆(A)、射干(B)、姜厚朴(C)、黄芩(D)水煎液对AV TH0426生长及其生物膜形成影响*表示与0%水煎液组比较P<0.05，下图同

图2 不同浓度五倍子(A)、红花(B)、黄连(C)及鹿衔草(D)水煎液对维氏气单胞菌TH0426生长及其生物膜形成影响

2.3 8味中药水煎液对AV TH0426生长及其生物膜形成的影响 不同浓度中药水煎液对AV TH0426的生长及生物膜形成的试验结果显示，五倍子与黄连在抑制细菌生长的同时，也抑制细菌生物膜的形成；红花对细菌生长无影响，但能有效抑制细菌生物膜形成；鹿衔草、地榆、射干、姜厚朴、黄芩对细菌生长及生物膜的形成影响不大。由图1、图2可知,随着药物浓度的升高，地榆、射干、姜厚朴、黄芩及鹿衔草水煎液对AV TH0426生长的抑制作用较弱，菌株生物膜形成能力降低缓慢，不能完全抑制菌株生物膜的形成。添加不同浓度的五倍子水煎液(图2-A)对AV TH0426生物膜形成能力有抑制作用，当五倍子水煎液浓度高于10%时，细菌生物膜形成能力呈下降趋势，当浓度达到40%时，细菌生物膜形成能力几乎为零。与之相一致的是，随着五倍子水煎液浓度的增加，细菌的生长呈下降趋势。随着红花水煎液(图2-B)浓度的增大，AV TH0426生物膜形成能力逐渐减弱，当红花水煎液浓度高于2.5%时，生物膜形成能力下降较为明显，与五倍子相反的是，各浓度(0%～40%)红花水煎液对细菌的生长无明显影响。随着黄连水煎液(图2-C)浓度增加，AV TH0426的生长呈下降趋势，且细菌生物膜形成能力也逐渐减弱。当黄连水煎液浓度低于5%时，对细菌的生长及生物膜形成能力均无影响；当黄连水煎液浓度高于5%时，细菌的生长有所下降，同时生物膜形成能力也有下降趋势，黄连水煎液浓度达到40%时，生物膜形成能力基本消失。与五倍子相比，黄连水煎液有效抑制生物膜形成的浓度比五倍子浓度低；但黄连水煎液与红花水煎液抑制作用结果有所不同，即高浓度黄连水煎液通过对细菌生长的抑制作用，使细菌生物膜形成能力减弱，而红花对细菌生长无明显抑制作用。

3 讨论

细菌生物膜(Biofilm, BF) 是指细菌附着于有生命或无生命材料表面，由细菌及其分泌的胞外多聚物共同组成的呈膜状的细菌群体，是细菌相对于浮游状态的一种群体生活方式。近年来，有关BF感染的报道(病例)明显增多[9]，细菌一旦形成生物膜，其对抗生素和消毒剂的抵抗力比浮游菌要显著增强，其引发的临床细菌感染率达65%[10]。本试验主要利用五倍子及红花等8味中药，探究其对AV TH0426生物膜形成能力的影响。

五倍子的主要成分是五倍子蹂质，能够凝固微生物体内的原生质及多种酶，对多种细菌、真菌、酵母都有明显的抑制作用[11]，该成分可能抑制细菌的生长，从而达到抑制生物膜的形成。本试验结果表明，随着五倍子水煎液浓度升高，菌株的生长及生物膜形成呈下降趋势，当浓度升高到40%时细菌的生长受到明显抑制，同时生物膜形成能力大大降低。因此五倍子水煎液具有抑制细菌生物膜形成的作用，且该作用可能是通过抑制菌株正常而实现的。细菌生长与生物膜生长的抑制作用不一定表现出平行关系。与五倍子相比，红花水煎液对AV TH0426生长几乎没有影响，但却对其生物膜形成能力有较强抑制作用。据文献报道，红花能够抑制变形链球菌附着能力，使菌斑形成量减少，细菌总蛋白亦下降，且菌斑中胞外葡聚糖含量降低[12]，这可能使得细菌分泌物无法聚集从而降低其附着能力。黄连的主要成分是黄连素，对于幽门螺旋杆菌的杀菌机制可能是抑制菌株呼吸及生长，抑制葡萄糖及糖代谢中间产物的氧化过程，从而杀灭细菌，被认为是抗微生物作用的有效活性物质[13]。当黄连浓度高于5%时，细菌的生长及生物膜形成受到明显抑制作用，当浓度达40%时，生物膜形成能力基本消失。因此，黄连水煎液可能通过抑制AV TH0426的正常生长从而削弱菌株生物膜的形成能力。因此，黄连水煎液抑菌机制可能与黄连素相关，有待进一步验证。

综合本试验结果可以看出，使用中草药防治维氏气单胞菌是可行的，但本研究仅探讨了中草药的体外抑制BF效果，因此，文中所选中草药在动物体内是否达到相同的抑制效果，有待进一步通过动物体内试验加以验证、比较研究。

[1] 夏飞，梁利国，谢骏.异育银鲫病原维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].淡水渔业，2012,42(5)；22-26.

[2] 龚倩，高淑琴，单晓枫，等.框镜鲤致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2010,32(12)：981-983.

[3] 杨求华，郭松林，关瑞章，等.鳗鲡病原性维氏气单胞菌的分离与鉴定[J]. 生物技术通报，2012,7: 134-139.

[4] 马志宏，杨慧，李铁梁，等.西伯利亚鲟 (Acipenser baerii) 致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J]. 微生物学报，2009 (10): 1289-1294.

[5] 彭程, 肖永红. 大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的作用[J]. 中国抗感染化疗杂志, 2001, 1(1): 7-9.

[6] 彭金菊, 马驿, 罗伟英, 等. 32 种中药及其复方对嗜水气单胞菌体外抑菌效果[J]. 中兽医医药杂志, 2009,28(6): 5-7.

[7] 任晓镤，陈伟，张利莉.甘草及醉马草水煎液对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响[J].中国兽医学报，2013，33(1): 125-128.

[8] 刘玉庆，颜世敢.大肠杆菌对中草药敏感性试验及其方法研究[J].中兽医医药杂志，2003,22(1): 3-5.

[9] Pal Z, Urban E, Dosa E,etal. Biofilm formation on intrauterine devices in relation to duration of use[J]. Journal of medical microbiology, 2005, 54(12): 1199-1203.

[10] National Committee Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. NCCLS, 2004,1- 159.

[11] 谢倩，李继遥，左渝陵，等.天然药物五倍子提取物对致龋菌生长的影响[J].华西口腔医学杂志，2005,23(1): 82-84.

[12] 凌均綮，樊明文.植物红花抑制变形链球菌附着的实验研究[J].1989(4)：217-220.

[13] 王建平，彭孝纬.单味中药治疗幽门螺杆菌的动物研究[J].胃肠病学和肝病学杂志， 2010; 19(4): 345-347.

Effects of Eight Chinese Herbs on Biofilm Formation of Aerornomas veronii

ZHANG Dong-xing1, KANG Yuan-huan1, LI Wen-ming2, ZHANG Hai-yue1,BI Jian-fei1, SHAN Xiao-feng1, QIAN Ai-dong1, TIAN Jia-xin1

(1.College of Animal Science and Technology , Jilin Agricultural University , Jilin 130118，China ; 2. Tieling Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau , Tieling 112000 ， China)

To investigate the role of Chinese herbs on biofilm formation of Aeromonas veronii TH0426, the effects of 8 kinds of Chinese herbs (Galla chinensis, Carthamus tinctorius L., Coptis Chinensis, Pyrda, Burnet ,Blackberry Lily, Jiang Magrolia and Scutellaria) on biolfilm formation of AV TH0426 were studied by using microplate quantification assay.The results showed that there were no obvious effects on growth and biofilm formation of AV TH0426 with low concentration of Galla chinensis,Carthamus tinctorius L., and Coptis Chinensis. The growth and biofilm formation of AV TH0426 was inhibited by high concentration of Galla chinensis and Coptis Chinensis.And the biofilm formation of AV TH0426 was inhibited significantly by high concentration of Carthamus tinctorius L.. But there was little effect on growth of AV TH0426 with high concentration of Carthamus tinctorius L..While the other 5 Chinese herbs had no obvious effects on growth and biofilm formation of AV TH0426.The inhibitory effect on biofilm of AV TH0426 was significant under the conditions of high concentration of Galla chinensis, Coptis Chinensis and Carthamus tinctorius L.The result will lay a theoretical foundation for preventing Aerornonas veronii on the aspect of anti-biofilm.

Galla chinensis; Carthamus tinctorius L.; Biofilm

s:SHAN Xiao-feng;Qian Ai-dong

2015-11-12

国家自然科学基金项目(31201927)；吉林省重点科技攻关项目(20150204065NY)

张冬星(1992-)，男，硕士生，从事动物分子细菌学研究，E-mail: xx498292459@163.com

单晓枫，E-mail: sxf1997@163.com；钱爱东，E-mail: qianaidong0115@163.com

S853.72

A

0529-6005(2016)11-0066-04