牛建蕊 ， 高志强 ， 蒲 静 ， 张 伟， 刘 环 ， 刘文晓 ， 张鹤晓

(1. 北京森康生物技术开发有限公司, 北京怀柔101400 ； 2. 北京出入境检验检疫局， 北京朝阳100026)

动物RNA病毒检测关键试剂—反转录酶(M-MLV RTase)的制备

牛建蕊1， 高志强2， 蒲 静2， 张 伟2， 刘 环2， 刘文晓1， 张鹤晓2

(1. 北京森康生物技术开发有限公司, 北京怀柔101400 ； 2. 北京出入境检验检疫局， 北京朝阳100026)

反转录酶是动物RNA病毒分子诊断用到的关键试剂之一。 为获得纯度高、 活性高、 制备简单经济的M-MLV RTase， 本试验将M-MLV RTase的基因序列进行密码子优化， 合成并构建表达载体。 将表达载体转化到大肠杆菌E.coliRosetta宿主菌种， 经IPTG诱导后实现M-MLV RTase的可溶性表达。 利用Ni2+柱亲和层析纯化载有6xHis标记的重组M-MLV RTase， 对重组酶进行Western Blotting试验， 鉴定为M-MLV RTase。 通过对动物流感病毒RNA的普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测来评价重组酶的活性并估测其活性单位。 将活性单位相当的重组酶和商品酶进行比较， 结果显示，制备的重组酶活性高， 对不同浓度病毒RNA的检测结果与商品酶相当。 研制的M-MLV RTase可以用于动物RNA病毒的分子诊断。

M-MLV RTase； 表达； 纯化； RT-PCR

动物疫病诊断和检测不外乎两大类方法，一是针对血清中抗体的血清学检测方法，一是针对病原体的病原学检测方法。抗体检测可以评估使用疫苗后的情况，以及判断是否曾经感染过某种动物疫病，病原学检测是确定动物携带病原体直接证据的方法。病原体分离的优点是结果准确，是病原诊断检测的金标方法，缺点是耗时长，需要几天甚至几周才能出结果，而且还伴随生物安全问题，需要一定生物安全级别的实验室才能进行。……