廖格斯，汪 宇，于士龙，赵庆春*

和胃颗粒质量标准研究

廖格斯1，汪 宇2，于士龙2，赵庆春1*

目的 建立和胃颗粒的质量标准。方法 采用TLC法定性鉴别处方中半夏、甘草、人参、黄连、干姜含量；采用HPLC法测定黄芩苷的含量。色谱柱为Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A、0.1%磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱；检测波长为280 nm；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃。结果 5种成分的薄层定性鉴别分离、专属性均较好；黄芩苷在0.070 26～1.053 86 μg范围内线性关系良好(r=0.999 9)，平均加样回收率为99.7%，RSD为1.01% (n=6)。结论 本方法可以较好地控制该制剂的质量。

和胃颗粒；质量标准；TLC；HPLC

0 引言

和胃颗粒是中国人民解放军第四六三医院生产的医院制剂，由法半夏、生姜、茯苓、人参、黄芩、甘草、黄连等十余味药材组成，具有益气和胃、消痞散结的功效。主要用于放、化疗引起的恶心、呕吐、食欲不振，也可用于慢性胃炎、胃动力不足、胃溃疡等疾病。在临床上有很大的需求。目前和胃颗粒的质量标准中，薄层鉴别药味少，且无含量测定项目。为了更好地控制该制剂的质量，笔者采用薄层色谱法对制剂中干姜、甘草、人参、黄芩、半夏进行定性鉴别，采用HPLC法测定处方中主要成分黄芩中指标成分黄芩苷的含量[1-2]，对质量标准进行了完善，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(日本岛津LC-2010AHT)；KQ3200E型昆山超声波处理器；电子分析天平(120D型，北京岛津公司)。黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量95.2%，批号：110715-200815)；和胃颗粒(中国人民解放军第四六三医院提供，批号：20140422、20140603、20140915)；半夏对照药材(批号：121272-201404)、甘草对照药材(批号：120904-201318)、人参对照药材(批号：120904-201318)、黄连对照药材(批号：120913-201310)、干姜对照药材(批号：120942-201309)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯，Tedia公司)，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 半夏薄层鉴别 取本品5 g，研细，加95%乙醇50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液置水浴锅上挥发溶剂至剩余约2 mL，作为供试样品液；根据本制剂中各种药材比例(半夏除外)，按制备工艺制成颗粒，按供试样品液制备方法制成阴性对照液；取半夏对照药材1 g，加95%乙醇20 mL，置超声波处理器中超声20 min，蒸干后的残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为对照药材溶液。分别用定量点样器在同一硅胶G薄层板上点样上述3种溶液各10 μL，于层析缸中展开[展开剂为正丁醇-冰醋酸-水(8∶3∶1)]，至展距16 cm取出，挥干板上残留溶剂后，喷以显色剂(茚三酮试液)，置烘箱中105 ℃加热约5 min。3批样品的供试样品斑点与半夏对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图1。

图1 半夏薄层色谱鉴别

2.2 甘草薄层鉴别 取本品5 g，研细，加甲醇50 mL，超声处理20 min，滤液置水浴锅上挥发溶剂至剩余约2 mL，作为供试样品液；根据本制剂中各种药材比例(甘草除外)，按制备工艺制成颗粒，按供试样品液制备方法制成阴性对照液；取甘草对照药材1 g，加甲醇20 mL，置超声波处理器中超声20 min，置水浴锅上挥发溶剂至剩余约2 mL，作为甘草对照药材溶液。分别用定量点样器在同一硅胶G薄层板上点样上述3种溶液各10 μL，于层析缸中展开[展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)]，至展距16 cm取出，挥干板上残留溶剂后，喷以显色剂(10%硫酸乙醇溶液)，置烘箱中105 ℃加热约5 min。3批样品的供试样品斑点与甘草对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图2。

图2 甘草薄层色谱鉴别

2.3 人参薄层鉴别 取本品3 g，研细，加入100 mL甲醇，置水浴锅内回流提取3 h，放冷，蒸至近干的滤液加水至20 mL，用水饱和正丁醇提取(共3次，20 mL/次)，合并提取液，用氨试液洗涤(共3次，20 mL/次)，弃去氨试液，再用正丁醇饱和的水溶液洗涤(共2次，20 mL/次)，取洗涤液蒸至近干后，加水至30 mL，得滤液，置水浴锅上挥发溶剂至约5 mL，通过D101大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm，柱高12 cm)先以水洗至流出液近无色，用400 mL 40% 乙醇溶液洗脱至无色，继续用70%乙醇溶液180 mL洗脱并收集洗脱液，水浴挥干溶剂后用1 mL甲醇溶解，作为供试样品溶液；根据本制剂中各种药材比例(除人参外)，按制备工艺制成颗粒，按供试样品溶液操作方法制成阴性对照溶液；另取人参对照药材1 g，同供试样品溶液方法制成对照药材溶液。分别用定量点样器在同一硅胶G薄层板上点样上述3种溶液各10 μL，于层析缸中展开[展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)]，至展距16 cm取出，挥干板上残留溶剂后，喷以显色剂(10%硫酸乙醇溶液)，置烘箱中105 ℃加热约5 min。3批样品的供试样品斑点与人参对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图3。

图3 人参薄层色谱鉴别

2.4 黄连薄层鉴别 取本品10 g，研细，加95%乙醇50 mL，超声处理20 min，滤液置水浴锅上挥发溶剂至剩余约2 mL，作为供试样品液；根据本制剂中各种药材比例(黄连除外)，按制备工艺制成颗粒，按供试样品液制备方法制成阴性对照液；取黄连对照药材1 g，加95%乙醇20 mL，置超声波处理器中超声20 min，滤液置水浴锅上挥发溶剂至剩余约2 mL，作为对照药材溶液。分别用定量点样器在同一硅胶G薄层板上点样上述3种溶液各10 μL，再用浓氨试液预饱和20 min的展缸内展开[展开剂为环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)]，至展距16 cm取出，挥干板上残留溶剂后，在365 nm紫外灯下检视。3批样品的供试样品斑点与黄连对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图4。

图4 黄连薄层色谱鉴别

2.5 干姜薄层鉴别 取本品10 g，研细，加95%乙醇50 mL，超声处理20 min，滤液置水浴锅上挥发溶剂至剩余约2 mL，作为供试样品液；根据本制剂中各种药材比例(干姜除外)，按制备工艺制成颗粒，按供试样品液制备方法制成阴性对照液；干姜对照药材0.5 g，加95%乙醇20 mL，置超声波处理器中超声20 min，滤液置水浴锅上挥发溶剂至剩余约2 mL，作为干姜对照药材溶液。分别用定量点样器在同一硅胶G薄层板上点样上述3种溶液各10 μL，再用浓氨试液预饱和20 min的展缸内展开[展开剂为环己烷∶乙酸乙酯(1∶1)]，至展距16 cm取出，喷以显色剂(香草醛硫酸试液)，置烘箱中105 ℃加热约5 min。3批样品的供试样品斑点与干姜对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图5。

图5 干姜薄层色谱鉴别

2.6 黄芩苷含量测定

2.6.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1的比例梯度洗脱；检测波长为 280 nm；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃。

2.6.2 溶液的制备 黄芩苷对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。供试品溶液的制备：精密称取事先研细的本品(0.2 g)，置25 mL的量瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密闭，称量。超声处理30 min，放冷，称重，加入70%乙醇至超声处理前溶液的重量，摇匀，滤过，即得。阴性对照样品溶液的制备：根据本制剂中各种药材比例(黄芩除外)，按制备工艺制成颗粒，再按供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液。色谱图见图6。

表1 梯度洗脱条件

2.6.3 标准曲线的制备 精密称取黄芩苷对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含0.035 13 mg的溶液，分别精密吸取该对照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，进样，按“2.6.1”项色谱条件测定6种不同浓度溶液峰面积，得回归方程(以进样量为横坐标、峰面积积分值为纵坐标作图)为Y=2 745.1X-29 859，r=0.999 9。结果表明，黄芩苷对照品量与测得的峰面积呈良好的线性关系(0.070 26～1.053 86 μg)。

2.6.4 黄芩苷对照品精密度试验 精密吸取含对照品的溶液(0.035 13 mg/μL)，按“2.6.1”项方法连续测定6次，测得峰面积值的RSD为0.33% (n=6)，符合要求。

2.6.5 稳定性 取同一批样品(批号：20140522)，按照“2.6”项下方法和条件进行分析，分别在0、4、8、12、16、24 h测定样品中黄芩苷峰面积，RSD为0.18% (n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.6 重复性试验 取同一批样品(批号：20140422)，按照“2.6”项下方法和条件进行制备及分析，测定每份溶液含量为平均标示量的99.8%，RSD为0.33% (n=6)，符合要求。

2.6.7 加样回收率试验 精密称取和胃颗粒(批号：20140422，黄芩苷含量为2.145 7 mg/g) 0.08、0.1、0.12 g 3个梯度样品，每个梯度3份，分别加入25 mL量瓶中；称取黄芩苷对照品(含量：95.2%) 5.96 mg，置100 mL量瓶中，70%乙醇定容至刻度，再分别取3.2、4.0、4.8 mL对照品溶液加入上述已称取和胃颗粒的3个梯度量瓶中，再加70%乙醇定容至刻度，密闭，称量。超声处理30 min，放冷，称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得，按“2.6”项下供试样品溶液方法和条件进行分析，其平均回收率为99.6%，RSD为1.01% (n=9)，结果见表2。

图6 和胃颗粒色谱图

序号取样量(g)峰面积样品中含黄芩苷的量(mg)对照品加入量(mg)实测值(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10．07981938750．50．171250．18160．3493299．0020．08174954949．00．175390．18160．3553499．5430．08235966689．50．176700．18160．35971100．3940．100541192545．00．215730．22700．44375100．2350．100831193668．00．216350．22700．44417100．3399．61．0160．100961181748．50．216630．22700．4397499．1270．125151454644．00．268530．27230．54128100．0880．122751440734．50．263380．27230．53611100．0890．122491430539．50．262830．27230．5323198．47

2.6.8 样品测定 取3个批号样品，按“2.6.2”项下供试品溶液制备操作，按该项下色谱条件测定各自样品中黄芩苷的含量。结果见表3。

表3 三批样品含量测定结果(mg/g，n=2)

3 讨论

3.1 干姜定性鉴别的优化 供试品溶液的制备中，笔者曾尝试采用2种方法提取：①用甲醇超声提取；②用95%乙醇超声提取。结果显示，2种方法薄层斑点都较清晰，考虑甲醇毒性较大，故将乙醇提取纳入正文。展开系统药典方法为石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯(2∶1∶1)，但三氯甲烷毒性大[3]，本文尝试选取环己烷-乙酸乙酯(1∶1)为展开剂，分离效果好，取3批样品试验，经过考查，该方法斑点清晰，重现性好，而且稳定，阴性无干扰，故将此方法列入正文。

3.2 提取方法考察 分别对溶剂用量、提取时间进行考察。溶剂用量考察：分别使用70%乙醇25、50、100 mL提取，黄芩苷的含量测定结果无显著性差异，为降低成本、减少污染，选用25 mL作为提取溶剂用量。提取时间考察：样品分别超声提取20、30、40 min，提取30、40 min时黄芩苷的提取率相近，且高于20 min时的提取率，故将提取时间定为30 min。

3.3 梯度洗脱条件考察 “2.6”项中，选择流动相时，根据中国药典[4]和相关文献[5-6]选择了甲醇-0.05%磷酸水溶液(三乙胺调pH值为3.0)梯度洗脱、甲醇-0.2%磷酸水(45∶55)及甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)为流动相进行考察，结果分离度及峰形均不理想，最后选择表1的梯度洗脱条件，黄芩苷的峰形较好，测定分离度符合要求。

[1] 张瑜,武斌,许建卫,等.黄芩药理作用的研究进展[J].医学综述,2013,19(6):1091-1093.

[2] 刘征辉,魏静娜,赵琳琳,等.黄芩提取物多指标成分鉴定及指纹图谱的研究[J].世界科学技术:中医药现代化,2015,17(1):156-161.

[3] 王子友.三氯甲烷职业中毒的预防[J].劳动保护,2010，(8):84-85.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:542-543.

[5] 张彦丽,王艳,李新霞,等.高效液相色谱法测定昆仑雪菊中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(4):107-109.

[6] 宋亚芳,毛娜,杨红,等.高效液相色谱法测定银黄颗粒中黄芩苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(15):99-100.

Quality standards for Hewei granules

LIAO Ge-si1,WANG Yu2,YU Shi-long2,ZHAO Qing-chun1*

(1.Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China;2.NO.463 Hospital of PLA,Shenyang 110042,China)

Objective To establish the quality standard for Hewei granules.MethodsPinelliaternata,Liquorice,Ginseng,CoptischinensisandRhizomazingiberiswere identified by TLC and the contents of baicalin were determined by RP-HPLC.The chromatography conditions were as follows:Agilent TC-C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm);the mobile phase consisted of A (acetonitrile) and B (0.1% phosphoric acid) with the column temperature being 25 ℃ and gradient elution;UV detection wavelength was set at 280 nm with the flow rate of 1.0 mL/min.The sample injection was 10 μL.Results The method of TLC had good resolution with clear spots,and negative control showed no interference.The good linearity was obtained within the range of 0.070 26～1.053 86 μg (r=0.999 9) for baicalin,and the average recovery was 99.7% (RSD=1.01%,n=6).Conclusion The established method is simple,accurate and sensitive for the the quality control of Hewei granules.

Hewei granules;Quality standards;TLC;HPLC

2016-05-12

1.沈阳药科大学，沈阳 110016；2.沈阳军区第四六三医院，沈阳110042

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201612020