杨红，张庆，侯建建，玉柱

(中国农业大学动物科技学院，北京 100193)



生物添加剂对羊草青贮饲料超微结构和纤维变化的影响

杨红，张庆，侯建建，玉柱*

(中国农业大学动物科技学院，北京 100193)

本试验旨在研究纤维素酶和乳酸菌的单独和复合添加对羊草青贮饲料超微结构和纤维组分的影响。将1060 U/g的纤维素酶(CEL)、1×105CFU/g的干酪乳杆菌(LC)、1060 U/g的纤维素酶和1×105CFU/g的干酪乳杆菌复合添加剂(LC+CEL)添加到羊草中经过切短后装入0.5 L青贮桶中制作青贮饲料，每个处理3个重复。在常温状态下贮存45 d，测定发酵品质和营养品质变化并用透射电镜观察其超微结构。结果表明，混合组LC+CEL的pH为3.86显著低于LC和CEL处理组(P<0.05)，乳酸和乙酸含量显著高于LC和CEL处理组(P<0.05)。与对照组相比，LC+CEL处理组显著降低43.9 g/kg的中性洗涤纤维、22.3 g/kg的酸性洗涤纤维、28.5 g/kg的纤维素和21.6 g/kg的半纤维素，增加20.5 g/kg的可溶性碳水化合物，29.2 g/kg乳酸。3个添加剂处理组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均显著低于对照组(P<0.05)，可溶性糖和有机酸含量显著高于对照组(P<0.05)。总之，添加生物添加剂能破坏羊草的细胞结构，提供可溶性碳水化合物作为发酵底物，快速降低pH促进厌氧发酵。复合添加干酪乳酸菌和纤维素酶降解细胞壁和细胞内容物，将其转化为可溶性糖和有机酸的效果最好，单独添加干酪乳酸菌和单独添加纤维素酶的效果次之。生物添加剂对羊草叶片不同部位和结构的细胞降解程度不同，羊草薄壁组织容易降解，木质化程度越高的厚壁细胞降解越困难。

羊草；细胞壁；生物添加剂；超微结构；纤维

羊草(Leymuschinensis)广泛分布于中国松内平原和内蒙古高原的东部草原，是中国北方草原的优势种[1]。羊草因其产量高、适应性强、适口性好，成为中国北方主要放牧和补饲牧草[2]。青贮与调制干草相比，技术路线简单，对天气依赖小，营养物质损失少，是理想的贮存羊草的方法。和大部分天然牧草一样，羊草也具有纤维含量高而可溶性糖类物质含量低、缓冲能值高的特点，常规青贮很难迅速进入厌氧发酵阶段，降低pH和达到理想的青贮效果较慢[3]。

生物添加剂有助于乳酸的快速产生，使青贮尽快到达厌氧发酵期[4]，因而广泛应用于青贮饲料的调制过程中。纤维素酶能快速增加前20 h纤维素转化成糖类的速度，增加发酵底物[5]，起到尽快降低pH的作用。Wang等[6]研究发现，添加外源纤维素酶能显著改善大麦秸秆和苜蓿干草的体外消化率。乳酸菌在厌氧条件下发酵将可溶性碳水化合物转化为以乳酸为主的有机酸，降低pH从而抑制有害微生物的活动，延长青贮饲料的保存时间[7]。刘丹[8]研究秸秆的化学添加剂预处理发现，化学处理能够破坏薄壁组织，使维管束组织扭曲，加快薄壁组织、厚壁组织和维管束组织的韧皮部降解。然而生物添加剂处理对细胞结构的作用，尤其是羊草细胞壁未开展过研究。本试验旨在探讨生物添加剂处理后羊草青贮饲料细胞壁结构的变化，并寻找这种变化和营养成分变化之间的关系。

1 材料与方法

1.1 青贮原料和添加剂

青贮原料为中国农业大学沽源-丰宁野外国家试验站天然草原野生生长的羊草，于2014年7月处于抽穗期刈割。添加剂：纤维素酶(cellulose enzyme, CEL)为固态的多组分酶系，由日本雪印公司生产，添加量为1060 U/g；干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei，LC)由中国农业大学青贮研究室提供分离自新鲜羊草饲料的乳酸菌，添加量为1×105CFU/g鲜草。羊草青贮原料化学成分见表1。

表1 羊草青贮原料化学成分

Table 1 Chemical compositions ofL.chinensis

干物质DM(g/kg)可溶性碳水化合物WSC(g/kgDM)粗蛋白CP(g/kgDM)中性洗涤纤维NDF(g/kgDM)酸性洗涤纤维ADF(g/kgDM)半纤维素HC(g/kgDM)纤维素C(g/kgDM)酸性洗涤木质素ADL(g/kgDM)390.544.288.7574.7297.0277.8220.046.5

DM: Dry matter; WSC: Water soluble carbohydrate; CP: Crude protein; NDF: Neutral detergent fiber; ADF: Acid detergent fiber; HC: Hemicelluloses; C: Cellulose; ADL: Acid detergent lignin.

1.2 试验设计与青贮制作

试验设4个处理，分别为：添加量为1060 U/g的纤维素酶(CEL)；1×105CFU/g的干酪乳杆菌(LC)；复合添加剂1060 U/g的纤维素酶+1×105CFU/g的干酪乳杆菌(LC+CEL)；对照组为添加与处理组等量的蒸馏水。总计4个处理，每个处理重复3次。新鲜刈割的羊草原料切短至2 cm左右，称取300 g装入体积为0.5 L的青贮桶中，使青贮料的密度为600 kg/m3。于青贮第45天开封取样进行分析。

1.3 样品分析

依据杨胜[9]的方法测定各处理青贮饲料样品的干物质(dry matter, DM)。按照Van Soest等[10]的洗涤纤维分析法测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)和酸性洗涤木质素(acid detergent lignin, ADL)的含量，并计算纤维素(cellulose, C)和半纤维素(hemicelluloses, HC)的含量。用凯氏定氮法测定粗蛋白(crude protein, CP)的含量[9]；采用蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)含量[11]。

pH测定：取20 g青贮饲料鲜样，加入180 mL蒸馏水，搅拌均匀，用组织捣碎机搅碎1 min，先后用4层纱布和定性滤纸过滤，得到浸出液，再用pH仪测定青贮饲料浸出液的pH[12]。使用SHIMADZE-10A型高效液相色谱分析乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid, PA)和丁酸(butyric acid, BA)含量；色谱柱：Shodex Rspak Kc-811s-DVB gel Column 30 mm×8 mm，检测器：SPD-M10AVP，流动相:3 mmol/L高氯酸，流速：1.0 mL/min，柱温50 ℃，检测波长210 nm，进样量5 μL[13]。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮(ammonia nitrogen, NH3-N)含量[14]。

从LC+CEL处理组、LC处理组、对照组中各随机取羊草青贮材料用于透射电镜的观察。选取第2节上叶片，距叶鞘3 cm并与叶脉垂直截取1.5～2.0 cm的叶片。重复取4～5片叶立即放入装有2.5%戊二醛溶液的注射器中，来回抽气多次至叶片悬浮于溶液中，后转入离心管中室温保存2 d以后4 ℃冰箱中保存。倒掉戊二醛固定液，然后用磷酸盐缓冲液冲洗3次，2%锇酸溶液固定3 h，磷酸盐缓冲液再洗3次，经各级乙醇脱水，进行常规树脂包埋，在超薄切片机上用钻石刀切片，再经醋酸铀和枸椽酸铅双重染色，置于透射电镜(Phillips Tecnai-12 TEM，荷兰)下观察，照相。

1.4 数据分析

用SPSS 19.0进行单因子方差分析，用Duncan法进行多重比较。以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 羊草青贮饲料发酵品质

各处理的发酵品质分析结果见表2，LC+CEL处理组的pH最低，LC处理组次之，都显著低于对照组和CEL处理组(P<0.05)。混合组LC+CEL的pH 为3.86，显著低于其他各组(P<0.05)，乳酸和乙酸含量分别为62.04和16.66 g/kg，显著高于其他各组(P<0.05)。对照组、CEL处理组和LC处理组的乙酸含量没有显著差异。丁酸含量在各组之间不存在显著差异。LC处理组的乳酸∶乙酸显著高于对照组 (P<0.05)。LC和LC+CEL处理组的氨态氮含量显著低于CEL处理组和对照组(P<0.05)。

表2 羊草青贮饲料的发酵品质

Table 2 Fermentation quality ofL.chinensissilage

发酵品质Fermentationquality对照CK纤维素酶CEL干酪乳杆菌LC干酪乳杆菌和纤维素酶LC+CELpH4.31±0.46a4.28±0.26a4.11±0.82b3.86±0.29c氨态氮NH3-N(g/kgTN)98.47±8.34a96.24±3.24a48.26±6.20b40.96±0.79b乳酸LA(g/kgDM)32.84±2.07c35.94±1.53c49.90±4.67b62.04±8.00a乙酸AA(g/kgDM)11.6±1.82b12.04±0.14b11.69±1.09b16.66±3.10a丙酸PA(g/kgDM)15.29±2.50a13.93±2.25a7.81±3.51b15.96±0.37a丁酸BA(g/kgDM)20.33±6.17a14.04±11.46a29.95±2.81a21.38±13.60a乳酸∶乙酸LA∶AA2.89±5.91b2.99±1.32ab4.28±4.52a3.86±10.98ab

注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
Note：The different letters within the same row mean the significant differences atP<0.05. The same below.

2.2 羊草青贮饲料细胞内碳水化合物组成

表3列出了羊草青贮饲料碳水化合物组成的变化。LC+CEL处理组中除ADL以外，NDF、ADF、纤维素、半纤维素和WSC含量均与对照组差异显著(P<0.05)。NDF、ADF在LC+CEL处理组中含量最低，分别为545.1和285.3 g/kg；CEL组次之，3个处理组都显著低于对照组 (P<0.05)。各处理组纤维素含量均显著低于对照组 (P<0.05)，3个试验组之间差异不显著。LC+CEL处理组中半纤维素含量为259.8 g/kg，显著低于其他各组(P<0.05)，羊草青贮饲料中WSC含量在LC+CEL处理组中最高，并显著高于其他3组(P<0.05)；LC处理组的WSC含量显著高于对照组(P<0.05)。

表3 羊草青贮饲料的营养成分组成

Table 3 Nutrient composition ofL.chinensissilage

营养成分Nutrientcomposition对照CK纤维素酶CEL干酪乳杆菌LC干酪乳杆菌和纤维素酶LC+CEL中性洗涤纤维NDF(g/kgDM)589.0±3.39a558.5±2.94c577.1±3.70b545.1±2.26d酸性洗涤纤维ADF(g/kgDM)307.6±6.14a288.1±2.15bc296.4±2.12b285.3±1.43c纤维素C(g/kgDM)261.7±1.89a226.5±0.57b234.2±0.29b233.2±0.35b半纤维素HC(g/kgDM)281.4±2.76a270.3±0.85b280.8±1.93a259.8±1.11c酸性洗涤木质素ADL(g/kgDM)47.8±2.56a53.2±0.52a48.6±1.29a49.7±2.65a可溶性糖WSC(g/kgDM)14.5±0.87c21.8±1.59bc24.8±1.89b35.0±3.75a

2.3.1 生物添加剂对羊草叶片薄壁细胞的影响 在透射电镜下，对照组、LC处理组和LC+CEL处理组羊草叶片的薄壁细胞发生了不同程度的变化(图1)。在2500倍透射电镜下观察到，对照组的羊草青贮饲料的薄壁细胞中存在大量易染色物质，细胞严重变形皱缩(图1A)；LC处理组薄壁细胞内易染色物质较少，并且细胞腔变大，细胞膜与细胞壁之间空隙变小(图1B)。LC+CEL处理组羊草青贮饲料的薄壁细胞中有极少的易染色物质，且观察不到完整细胞结构(图1C1)；在25000倍的透射电子显微镜下观察到点状或絮状的薄壁细胞破坏后的细胞内容物(图1C2)。

图1 透射电子显微镜下羊草青贮饲料薄壁细胞的变化Fig.1 Changes of parenchyma cell transmission electron microscopy L. chinensis silage A: 对照组TEM 2500倍 Untreated TEM 2500 times; B: LC处理组TEM 2500倍 LC TEM 2500 times; C1: LC+CEL处理组TEM 2500倍LC and cellulose TEM 2500 times; C2: TEM 25000倍 TEM 25000 times.

2.3.2 生物添加剂对羊草叶片厚壁细胞形态的影响 从7000和8000倍透射电镜图片可知，对照组、LC处理组和LC+CEL处理组靠近表皮的厚壁细胞仍保持其原有形态，胞间层、初生壁和次生壁均保持其完整状态。在25000倍透射电镜观察下，对照组的厚壁细胞细胞壁有明显分层(图2F1)，LC处理组的厚壁细胞细胞壁在靠近细胞液侧有分层而在两厚壁细胞交界处无明显变化(图2F2)。LC+CEL处理组细胞壁在25000倍透射电镜下无明显变化(图2F3)。

进一步用透射电镜将厚壁细胞放大至100000倍观察，对照组、LC和LC+CEL处理组在靠近表皮侧细胞壁有较厚的蜡质层。细胞壁中丝状纤维延伸到蜡质层形成紧实的复合结构，角质层高度硅化(图3)。

图2 对照都、LC处理组和CEL+LC处理组厚壁细胞和厚壁细胞壁的变化Fig.2 Changes of sclerenchyma cell after treatments by untreated, cellulose, LC and cellulose E1：对照组TEM 8000倍 Untreated TEM 8000 times; E2：LC处理组TEM 7000倍LC TEM 7000 times; E3：CEL+LC处理组TEM 7000倍LC and cellulose TEM 7000 times; F1～F3: 对照组，LC处理组和CEL+LC处理组TEM 25000倍Untreated, LC, LC and cellulose TEM 25000 times.

图3 对照组(G)、LC(H)和CEL+LC(I)处理组厚壁细胞壁的变化Fig.3 Changes of sclerenchyma cell after treatments by untreated(G)、LC(H) and LC+CEL(I) G～I: TEM 100000 倍 TEM 100000 times.

通过高倍的透射电子显微镜可以发现，厚壁细胞在靠近薄壁细胞侧与远离薄壁细胞侧的细胞壁厚度不一致(图4L～N)，远离侧厚于靠近侧。厚壁组织与薄壁组织交界处的厚壁细胞内无明显易染色物质积累。从100000倍透射电镜图片可知，LC处理组两厚壁细胞细胞壁之间的胞间层有部分损坏(图4P)，对照组(图4O)无明显变化；而LC+CEL处理组两厚壁细胞细胞壁之间接触面损坏程度远大于LC处理组，胞间层结构不完整 (图4Q)。

图4 厚壁组织与薄壁组织交界处的厚壁细胞和厚壁细胞壁的变化Fig.4 Changes of cells and cell wall between the parenchyma cells and sclerenchyma cells L: 对照组TEM 5000倍Untreated TEM 5000 times; M: LC处理组 TEM 3500倍LC TEM 3500 times; N: CEL+LC处理组TEM 3000 LC and cellulose TEM 3000 times；O: LC处理组 TEM 100000倍LC TEM 100000 times; PQ: LC+CEL处理组 TEM 100000倍LC and cellulose TEM 100000 times.

3 讨论

3.1 羊草青贮饲料发酵品质

羊草由于附着的乳酸菌较少，WSC含量较低，很难快速厌氧发酵并产生有机酸，降低pH[15]。乳酸和乙酸是青贮饲料中引起pH降低的主要原因。与其他试验组相比，混合添加LC+CEL后羊草青贮饲料的pH和氨态氮含量最低，乳酸含量和乙酸含量最高。本试验中混合添加乳酸菌和纤维素酶以后，增加了发酵初期乳酸菌的数量和发酵底物，使得乳酸菌大量繁殖并快速产生乳酸降低pH，有效地抑制了有害微生物的活动从而减少氨态氮产生。说明复合添加乳酸菌和纤维素酶的 LC+CEL处理组发酵品质明显优于单独添加乳酸菌的处理组和单独添加纤维素酶的处理组。纤维素酶与乳酸菌之间的叠加效应可能是其效果好的原因[16]。

3.2 羊草青贮饲料细胞内碳水化合物组成与超微结构变化

在骨折后6 h内实施急诊干预手术，患肢取仰卧位，经臂丛麻醉后上肢呈外展位，常规消毒、铺无菌洞巾，在桡骨掌侧、桡侧做长约4～6 cm的纵形切口，切开筋膜，分离桡侧腕屈肌和掌长肌，再钝性分离肌肉、软组织等，显露骨折端，清除血肿后游离骨折端解剖标志线，整复骨折。再给予复位，放置锁定T形板固定，注意保持骨折解剖力线和腕部的稳定性。在C型臂透视下可见复位满意后，冲洗、缝合切口。

植物细胞由细胞质、细胞膜和细胞壁组成，细胞质和细胞膜中含有全部的可溶性糖，蛋白质、脂类和有机酸等，能够完全被动物消化。植物细胞壁成分主要由纤维层和果胶组成[17]，包括纤维素，半纤维素、木质素和果胶等。成熟禾草的维管束包含初生木质部、次生木质部和非木质化的韧皮部。维管束外面为木质化的厚壁组织包围[18]。牧草叶片组织结构的多样性，是其降解特性差异的主要原因。比如，非木质化的薄壁细胞很容易降解，而木质化程度较高的厚壁细胞即使经过瘤胃微生物的作用也几乎不被降解[19]。Moon等[20]研究发现，未添加青贮添加剂青贮以后，叶片的维管束组织和表皮细胞结构完整，气孔和叶肉细胞内被破坏。

从各营养物质变化来看，不同处理组对羊草的处理效果有差异，干酪乳杆菌和纤维素酶复合添加更容易降解细胞中的营养物质，单独添加干酪乳杆菌和单独添加纤维素酶后降解效果减弱，单独添加纤维素酶的效果低于单独添加乳酸菌。复合添加干酪乳杆菌和纤维素酶，NDF，ADF，纤维素和半纤维素含量降低，可溶性糖含量增加。单独添加干酪乳杆菌与纤维素酶，NDF, ADF, 纤维素和半纤维素含量降低更少，同时可溶性糖含量增加更少。进一步分析发现，添加干酪乳杆菌、纤维素酶、干酪乳杆菌和纤维素酶复合添加剂以后，不同程度的降解羊草组织细胞结构，导致各处理NDF、ADF、纤维素和半纤维素含量减少，而转化为可溶性糖和乳酸等有机酸。处理后，更利于降解的WSC和有机酸含量增加，而结构复杂的NDF，ADF和半纤维素含量减少，这表明青贮过程中纤维被微生物降解为更易消化的可溶性糖和发酵产物有机酸。

生物添加剂对羊草内纤维不同部位和结构降解的程度不同，对薄壁组织降解最强烈，木质化程度越高的细胞降解越困难。最易被微生物降解的薄壁组织，在干酪乳杆菌和纤维素酶LC+CEL复合添加剂处理下已经观察不到完整的细胞结构；LC单独处理较对照组细胞壁变薄细胞腔变大；而对照组细胞结构完整，细胞壁皱缩细胞内有大量易染色物质存在。对照组在青贮以后薄壁细胞的变化与陈尚鈃等[21]发现酸类物质处理可以不同程度破坏纤维表面和细胞壁的结论一致。本试验中，维管束组织附近的厚壁细胞木质化且细胞壁外有硅化的蜡质层，在各生物添加剂处理以后仍保持原有细胞结构。Akin等[22]、Engels 等[23]总结瘤胃中牧草茎秆的降解规律与细胞壁的关系中发现，厚壁细胞由于细胞壁分层，在瘤胃中也很难被微生物降解；次生细胞壁由于木质化不同只能部分降解，中层细胞壁由于木质素和纤维素结合成牢固的化学键不能被瘤胃微生物降解。LC单独处理和复合添加LC+CEL，能使厚薄壁细胞邻近的胞间层结构不完整仅有丝状结构相连，并且复合添加处理的效果更好。生物添加剂对青贮过程中细胞壁的作用，对于提高牧草在瘤胃中的降解速度和改善消化具有促进作用。

4 结论

添加生物添加剂能破坏羊草的细胞结构，提供更充足的可溶性碳水化合物作为发酵底物，快速降低pH促进厌氧发酵。复合添加干酪乳酸菌和纤维素酶降解细胞壁和细胞内容物，将其转化为可溶性糖和有机酸的效果最好，单独添加干酪乳酸菌和单独添加纤维素酶的效果次之。生物添加剂对羊草叶片不同部位和结构的细胞降解的程度不同，羊草茎的薄壁组织容易降解，木质化程度越高的厚壁细胞降解越困难。

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Effect of biological additives on ultrastructure and fiber content ofLeymuschinensissilage

YANG Hong, ZHANG Qing, HOU Jian-Jian, YU Zhu*

CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100193,China

The aim of this study was to determine the effects of adding the cellulose (CEL) andLactobacilluscasei(LC) separately or together on the quality ofLeymuschinensissilage. ChoppedL.chinensiswas supplemented with 1060 U/g cellulose, 1×105CFU/g fresh matterL.casei, or both (LC+CEL). ChoppedL.chinensiswith no additives served as the control. Three replicates of each treatment were weighed and chopped into 0.5 L plastic buckets, and these mini silos were stored at ambient temperature for 45 days. The ultrastructure of stems, fermentation quality, and nutrient composition of theL.chinensissilage were analyzed. The pH in the LC+CEL mixture was 3.86, which was significantly lower than those in the LC and the CEL treatments (P<0.05), but the lactic acid and acetic acid contents in the LC+CEL mixture were significantly higher than those in the LC and the CEL treatments (P<0.05). The LC+CEL mixture showed significantly decreased neutral detergent fiber (43.9 g/kg), acid detergent fiber (22.3 g/kg), cellulose (28.5 g/kg), and hemicellulose (21.6 g/kg) contents, and increased water soluble carbohydrates (20.5 g/kg) and lactic acid (29.2 g/kg) contents after 45 days of fermentation. Compared with the control (no additives), all of the treatments showed significantly lower neutral detergent fiber and acid detergent fiber contents, and significantly higher water soluble carbohydrates and organic acids contents (P<0.05). Overall, the LC+CEL mixture performed better in terms of degrading fiber to water soluble carbohydrates and organic acids than did either LC or CEL, but all of the treatments performed better than the control. The biological additives degraded the different tissues to varying degrees, with greater degradation of parenchyma tissue and less degradation of lignified tissue.

Leymuschinensis; cell wall; biological additives; ultrastructure; fiber

10.11686/cyxb2016059

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-01；改回日期：2016-04-28

国家牧草产业技术体系(CARS-35)，公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303061)，天津市农业科技成果转化与推广项目(201404040)和内蒙古自治区科技计划项目(苜蓿混合青贮调制技术研究与示范)资助。

杨红(1989-)，女，江苏徐州人，在读硕士。E-mail:yanghong1221@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: yuzhu3@sohu.com

杨红, 张庆, 侯建建, 玉柱. 生物添加剂对羊草青贮饲料超微结构和纤维变化的影响. 草业学报, 2016, 25(12): 94-101.

YANG Hong, ZHANG Qing, HOU Jian-Jian, YU Zhu. Effect of biological additives on ultrastructure and fiber content ofLeymuschinensissilage. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 94-101.