周剑

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121）

托吡卡胺滴眼液的抑菌效力测定

周剑

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121）

目的 测定托吡卡胺滴眼液中抑菌剂的抑菌效力。方法 以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、黑曲霉和白色念珠菌为试验菌株，进行菌落计数方法学验证和微生物挑战试验，根据各间隔时间的菌数lg值相对于初始值减少程度评价托吡卡胺滴眼液对细菌、真菌的抑菌效力。结果 部分托吡卡胺滴眼液中抑菌剂的抑菌效力符合2010年版《中国药典》的规定，但不符合2015年版《中国药典》通则1121抑菌效力检查法的规定。结论 2010年版《中国药典》和2015年版《中国药典》通则1121抑菌效力的判断标准差异较大，部分已上市品种的抑菌剂效力达不到2015年版《中国药典》的要求。

托吡卡胺滴眼液；抑菌效力；评价

眼用制剂为多剂量包装制剂，易在贮藏和使用过程中发生微生物污染和繁殖，对药物的质量及疗效产生影响[1]，需加入抑菌剂，避免微生物生长与繁殖[2]。若无合理的防腐体系，环境中的微生物一旦大量侵入，则有可能破坏产品的品质或损害患者健康。建立良好的防腐体系，对于滴眼液的品质十分重要[3]。托吡卡胺滴眼剂，适应证为滴眼散瞳和调节麻痹，在使用中需反复打开，易被泪液及空气中的微生物污染，从而产生安全隐患[4－5]。对其抑菌剂的抑菌效力进行测定，可有效保障产品质量，而目前尚未见托吡卡胺滴眼液抑菌效力研究的报道，实际检测结果与2010年版《中国药典》[6]、2015年版《中国药典》[7]抑菌效力差异较大，故按照2个版本的《中国药典》中的抑菌效力检查法对托吡卡胺滴眼液的抑菌效力进行了考察，现报道如下。

1 仪器、试药与菌株

1．1 仪器

1．2 试药

托吡卡胺滴眼液（山东博士伦福瑞达制药有限公司＜简称山东博士伦＞，批号为140809；安徽双科药业有限公司 ＜简称安徽双科 ＞，批号为140703，规格均为6 mL∶15 mg）；营养肉汤培养基（批号为130520）、胰酪胨大豆琼脂培养基（批号为141112）、改良马丁培养基（批号为 1402032）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号为20130710）均由中国食品药品检定研究院提供。

1．3 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、铜绿假单胞菌[CMCC（F）98003]均由中国食品药品检定研究院提供。

2 方法与结果

2．1 菌种及菌液制备

菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]。

菌液制备：取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌肉汤培养物，分别用0．9%无菌氯化钠溶液稀释至每1 mL含菌约108cfu的菌悬液，备用。取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌液体培养物，用0．9%无菌氯化钠溶液稀释至每1 mL含菌约108cfu的菌悬液，备用。取经25℃培养6 d的黑曲霉菌斜面培养物，加入含0．05%（mL／mL）聚山梨酯80的0．9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）置无菌试管内，用0．9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子108cfu的孢子悬液。

2．2 试验方法

大豆卵磷脂稀释液是近年稀释液研究的热点，Forouzanfar等[8]在冷冻保存绵羊精液试验中，发现用1%大豆卵磷脂效果高于15%卵黄，证明大豆卵磷脂可以替代卵黄。Depaz等[9]用大豆卵磷脂在低温与常温下保存绵羊精液，结果表明精子在卵黄中的运动性较差。本试验在0 ℃冰水混合物中保存绵羊精液，发现使用1. 25%大豆卵磷脂替代卵黄保存精子效果显著高于其他浓度(P<0. 05)，与蔡虹[10]等3%的添加量，孟娜娜[11]等0. 375%最优添加量有一定偏差。所以证明为了确保精子的运动处于最好的状态，大豆卵磷的添加剂量必须有一定的限度。

受试品溶液制备：直接取样品作为受试品溶液。

供试品接种：取受试品溶液5份，转移至5个适宜的无菌容器中，每个容器接种1种试验菌，供试品中接种菌量为105～106cfu，充分混匀，使供试品中的试验菌均匀分布。然后将接种的供试品在试验期间置22℃避光保存。

存活菌测定：在供试品接种0 h，6 h，1 d，7 d，14 d，28 d时，分别从上述每个容器中取供试液 1 mL，用pH＝7．0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液稀释，采用平皿法进行存活菌数测定，细菌测定用胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基，真菌测定用沙氏葡萄糖琼脂培养基。根据菌数测定结果计算1 mL供试品各试验菌所加菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。

2．3 试验结果

2．3．1 微生物挑战性试验

结果见表1。

表1 微生物挑战性试验结果

2．3．2 存活菌测定结果

与初始值比较，7 d后存活的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌菌数的lg值下降均大于1．0，符合2010年版《中国药典》规定；与初始值比，14 d后存活的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌菌数的lg值下降均大于3．0，符合2010年版《中国药典》规定；与14 d的菌数相比，28 d后存活的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌菌数均未增加，符合2010年版《中国药典》规定；样品的真菌数与初始值比，7，14，28 d的黑曲霉和白色念珠菌菌数均未增加，符合2010年版《中国药典》要求。可见，2个厂家生产的托吡卡胺滴眼液中抑菌剂的抑菌效力均符合2010年版《中国药典》中抑菌效力检查法的判断标准。详见表2。

2．3．3 抑菌效力检查结果

与接种的细菌菌数lg值相比，6 h存活的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌数lg值下降，山东博士伦6 h存活的铜绿假单胞菌下降值为2．4，满足2015年版《中国药典》规定应达到的抑菌效力“A”标准，其余下降值均小于2．0，不能满足上述标准；1 d存活的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌数lg值下降，山东博士伦下降值均大于3．0，满足公示稿中要求的应达到的抑菌效力“A”标准，而安徽双科均小于3．0，不能满足公示稿中的同一标准；7 d存活的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的lg值2个厂家下降均大于3．0；14 d和28 d，2个厂家的滴眼液均未检出试验菌。可见，托吡卡胺滴眼液中抑菌剂的抑菌效力存在不符合2015年版《中国药典》中的抑菌效力判断“A”标准的情况。详见表3。

表2 7，14，28 d后与初始值相比lg值下降值

与接种的真菌菌数lg值相比，2个厂家7 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的 lg值下降值均大于 2，满足2015年版《中国药典》中规定应达到的抑菌效力“A”标准；2个厂家14 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的lg值下降值均大于1，满足2015年版《中国药典》中规定应达到的抑菌效力“B”标准（14 d lg值下降值判定，2015年版《中国药典》“A”标准无相关规定）；与14 d的真菌菌数相比，2个厂家28 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的菌数未增加，满足2015年版《中国药典》中规定应达到的抑菌效力“A”标准。详见表4。

表3 与接种细菌菌数lg值相比不同时间点下降值

表4 与接种真菌菌数lg值相比不同时间点下降值

3 讨论

抑菌效力检查无论是对消费者还是生产企业都至关重要，防腐剂添加过少，会使微生物繁殖而引起污染，防腐剂添加过多，会引起不适或过敏等不良反应，故适量添加防腐剂尤为重要[8]。2015年版《中国药典》更新了抑菌效力检查法，并根据欧美药典的最新要求提高了抑菌效力的判断标准[9]。多剂量包装的滴眼液需在处方中适当添加适宜的抑菌剂来保持产品在贮存和使用过程中具有一定的抑菌能力[10]。同时，添加的抑菌剂多少都会具有一定毒性，故必须进行充分的试验研究，严格控制抑菌剂的种类和用量，保证用药安全[11]。

不同厂家生产的滴眼液的抑菌效力存在较大差异，如何选择抑菌剂，以及如何实现药物中所含抑菌剂的量为最低有效剂量，仍为抑菌效力检查试验的难点[12－13]。抑菌剂使用量的界限一直都很模糊，过量易导致人体受损，不足则增加微生物污染的可能性[1]。目前，国内市场上的滴眼液可能存在防腐剂远超抑菌效力要求的情况。如张世磊等[2]在萘敏维滴眼液抑菌效力试验中发现，7 d所有试验菌株的菌落数均下降为0；肖璜等[5]研究发现，现行产品氯霉素滴眼液中的尼泊金乙酯处方浓度偏高。安彦[14]的研究结果显示，抑菌剂的效力不仅与所使用的抑菌剂种类及含量相关，同时也与其他成分及制剂工艺有关，特别应关注pH、等电点、表面活性剂、生物制剂的蛋白含量等因素，其协同效应值得进一步研究，也提示对添加抑菌剂的制剂进行抑菌剂效力评价的必要性[15]。

四国药典[《美国药典》（USP)，《欧洲药典》(EP)，《日本药典》(JP)，《中国药典》(ChP)]均收载有抑菌剂效力检查法，但测定方法和标准并不统一，EP要求考察6，24 h和7，14，28 d共5个时间点，USP和ChP要求考察7，14，28 d 3个时间点，而JP仅考察14，28 d 2个时间点[16]。本研究中结合ChP和EP的相关要求，在6 h，24 h，7 d，14 d，28 d共5个时间点进行考察，更能比较出不同产品抑菌剂效力之间的差异，也更符合滴眼液实际用药的需要。

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Bacteriostatic Effect Assay of Tropicamide Eye Drops

Zhou Jian
（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing，China 401121）

Objective To detect the bacteriostatic effect of Tropicamide Eye Drops．M ethods Staphylococcus aureus，Pseudomonas aeruginosa，Escherichia coli，Aspergillus and Candida albicans were used as test strains，the colony－count method validation was studied．According to the verified method，the microbiological method and various time－gap colony counting lg，compared with original value，were applied to evaluate bacteriostatic effects of Tropicamide Eye Drops for bacteria and fungus．Results The effect of bacteriostatic agent of pirenoxine ophthalmic solution was confoumable to the standard of Ch．P（2010），but was not confoumable to the standard of the general public draft 1121 of Ch．P（2015）．Conclusion There are great differences for the estimate standard of preservatives－effectiveness between the Ch．P（2010）and the general public 1121 of Ch．P（2015），and the preservatives－effectiveness in part of the listed varieties do not meet the requirement of the latter．

Tropicamide Eye Drops；bacteriostatic effect；evaluation

R927．11；R988．1

A

1006－4931(2016)10－0069－03

周剑（1980－），男，大学本科，工程师，研究方向为药物分析微生物，（电子信箱）40257199＠qq．com。

2016－01－10；

2016－02－09)