王绍辉 刘同祥

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京100081)



苏铁总黄酮对Lewis肺癌模型小鼠的抑制作用及免疫功能的影响①

王绍辉 刘同祥

(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京100081)

目的：探讨苏铁总黄酮对Lewis 肺癌模型小鼠的抑制作用及免疫功能的影响。方法：选取造模成功的荷瘤小鼠84只，随机分为模型组、空白对照组、苏铁总黄酮高、中、低剂量组、顺铂组、联合组，每组12 只。分别给药干预14 d，于第15天摘眼球法取血，常规法剥取肿瘤组织、肺、脾、胸腺，并分别称重，计算抑瘤率、肺脏指数、脾脏指数和胸腺指数；采用ELISA 法检测血清中IL-2、IL-10的含量。结果：苏铁高、中、低各剂量组、顺铂组和联合组小鼠瘤质量与模型组比较均降低，差异具有显著意义(P<0.01)，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组的脾脏指数和胸腺指数明显增加，且远远高于顺铂组与联合组。ELISA 法检测结果显示，与模型组比较，苏铁总黄酮高中低各剂量组、顺铂组和联合组的IL-2水平明显升高，而IL-10水平除了苏铁总黄酮中剂量组之外的其他各组均明显升高。结论：苏铁总黄酮可以调节免疫细胞因子IL-2、IL-10 的表达水平，抑制Lewis 肺癌模型小鼠肿瘤细胞的生长与转移并提高其免疫功能。

苏铁总黄酮；Lewis 肺癌；肺指数；脾指数；胸腺指数；免疫功能

肺癌是世界上最常见的原发于肺部的严重威胁着人类生命健康和生存质量的恶性肿瘤，随着大气污染的加重，其发病率和死亡率已居各种恶性肿瘤的首位，是全球男性癌症患者相关死亡的首要原因和女性癌症患者相关死亡的第二大原因[1]。近年来，我国的肺癌发病率和死亡率的上升更为显著，大约每年超过60万人死于肺癌，每年因肺癌死亡的人数多于乳腺癌、前列腺癌和肠癌死亡人数的总和，青年肺癌发病率有所上升[2]。苏铁(Cycas Revolute)为苏铁科苏铁属常绿棕榈状木本植物。具有清热、止血、散瘀的功效，用于痢疾、吐血、便血、胃痛、尿血、月经过多、跌打肿痛[3,4]。近几年来，研究者发现苏铁中的黄酮类化合物含量较高[5,6]，现代药理学研究表明，苏铁内含铁树素(Cyasine)及新铁树素甲、乙具有抗癌活性，广泛用于药品、食品等方面[7]。免疫监视作为免疫系统的主要功能之一，其在清除肿瘤细胞方面发挥着重要作用[8]，为进一步研究和开发苏铁，本实验拟通过对苏铁总黄酮抑制Lewis肺癌模型小鼠的作用进行研究，并观察其对Lewis肺癌模型小鼠的免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 双人单面净化工作台(100级)(SW-CJ-2FD型)，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；生物显微镜(UB200i)，购自重庆澳浦光电技术有限公司；台式大容量冷冻离心机(Centrifuge 5804R)，购自德国Eppendorf公司；微孔板检测系统(FlexStation3)，购自美国分子仪器公司；电热恒温水浴锅(DK-98-1型)，购自天津市泰斯特仪器有限公司；实验室级超纯水器，购自上海canrex分析仪器有限公司；电热鼓风干燥箱(101-1AB)，购自天津市泰斯特仪器有限公司；万分之一电子分析天平(AL104型)，购自德国Mettler Toledo公司；隔水式电热恒温培养箱，购自上海市跃进医疗器械一厂；解剖显微镜。

1.1.2 实验细胞和动物 Lewis肺癌瘤源细胞由中国少数民族传统医学研究院民族药物物质基础研究所黄火强教授惠赠； SPF级C57BL/6小鼠，共100只，6～7周龄，体重(21±2.1)g，雄性，由中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号：SCXK(京)2014-0004；

1.1.3 实验药品及试剂 苏铁总黄酮(自制，含量90%)，注射用顺铂(齐鲁制药有限公司，批号：H37021358)；PBS缓冲液、BOUIN氏液(临用现配)；小鼠IL-2 ELISA试剂盒、小鼠IL-10 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 Lewis肺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2培养箱中常规培养，传代后，待细胞达到所需量时，显微镜下计数，调至所需要浓度，以0.2 ml(约1×106个细胞)接种于C57BL/6J近交系小鼠右腋部背侧皮下，14 d后以颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，剥离肿瘤组织，制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/ml，取上述瘤细胞悬液0.2 ml(含细胞数1×106个)接种于C57BL/6J小鼠右腋部背侧皮下，以接种后第2～9天于小鼠右腋皮下触摸到肿瘤结节(肿瘤平均直径达到约5 mm)为建模成功，将动物随机分组开始给药。

1.2.2 分组与给药 选择肿瘤体积较均匀的84只荷瘤小鼠随机分成模型组(Model)、苏铁总黄酮高剂量组(H)、苏铁总黄酮中剂量组(M)、苏铁总黄酮低剂量组(L)、顺铂组(S)、联合组(顺铂+苏铁总黄酮中剂量，C)、空白对照组(Control)，每组12只。模型组和空白对照组小鼠每天灌胃生理盐水0.4 ml，共14 d；苏铁总黄酮组小鼠每天灌胃0.4 ml，共14 d；顺铂组小鼠于第1、3、5天腹腔注射0.4 ml；联合组小鼠上午灌胃苏铁总黄酮中剂量0.2 ml，于第1、3、5天下午腹腔注射顺铂0.2 ml，共14 d。

1.2.3 观察指标及测定方法

1.2.3.1 一般情况观察评估 观察各组小鼠精神状态、活动情况、毛发、饮食、大小便等情况。每日称体重，记录体重变化。

1.2.3.2 肿瘤体积变化情况测定 给药后第7、10、13、16、19天用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的最大长径(a)和最小短径(b)，按照公式V=0.52×ab2计算荷瘤小鼠肿瘤体积及各组均值，绘制肿瘤生长曲线。

1.2.3.3 肺脏指数、脾脏指数、胸腺指数及抑瘤率测定 摘眼球取血后，颈椎脱臼法处死小鼠，剥取肿瘤组织，摘取肺脏、脾脏和胸腺，剔除正常黏连组织后称重，计算抑瘤率：抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%，肺脏指数=肺脏质量/体质量，脾脏指数=脾脏质量/体质量，胸腺指数=胸腺质量/体质量。

1.2.3.4 有无转移灶及其转移率测定 眼球采血后，采取脱颈法处死小鼠，将其固定于解剖蜡板上，用眼科剪剖开胸腔至喉以上部位，小心剥离出气管，用6号针头插入气管并于针管处结扎，防止Bouin液回流，缓慢注入适量Bouin液，待小鼠肺脏充分膨胀后，结扎针头下端气管，抽出针头，与结扎上部将气管剪断，然后取出气管和肺脏，放于Bouin液中24 h固定肺组织。第2天可见黄色肺组织，有粉白色隆起为小鼠肺转移灶，在解剖显微镜下仔细计数小鼠肺转移灶。将肺转移灶分为四个等级：Ⅰ级，<0.5 mm；Ⅱ级，≥ 0.5 mm且<1 mm；Ⅲ级，≥ 1 mm且≤ 2 mm；Ⅳ级，>2mm。肿瘤表面转移灶总数=Ⅰ×1+Ⅱ×2+Ⅲ×3+Ⅳ×4(个)。肿瘤转移抑制率(%)=(1-实验组平均肺表面转移瘤数/对照组平均肺平面转移瘤数)× 100%。

1.2.3.5 小鼠血清中IL-2和IL-10的含量检测 接种第20天，动物禁食不禁水，停药24 h后，采用摘眼球法取血，静置，3 000 r/min离心5～10 min，取上清，分装待测。采用双抗体夹心ELISA法检测血清中IL-2和IL-10的含量。

2 结果

2.1 一般情况 在实验过程中发现，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组小鼠的生存状况明显好于顺铂组和联合组。与模型组比较，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组小鼠精神状态佳，食欲正常，体重质量浮动不大，毛色黑亮光润，喜动恶静；联合组小鼠则食欲不振，体重呈逐渐减轻趋势，减轻幅度不大，毛色没有光泽，喜静厌动；顺铂组小鼠生存状态极差，食欲欠佳，饮食量少，体重大幅度下降，部分小鼠出现脱毛现象。

2.2 苏铁总黄酮对Lewis肺癌模型小鼠肿瘤生长的影响 与模型组比较，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组小鼠的体质量基本呈逐渐上升趋势，提示给予肿瘤小鼠苏铁总黄酮高、中、低各剂量，可以增强其食欲。顺铂组和联合组小鼠体质量逐渐下降，联合组小鼠体质量下降幅度小，提示苏铁总黄酮在一定程度上可以缓解顺铂对肿瘤小鼠的毒副作用，而顺铂组小鼠体质量下降幅度大，提示苏铁总黄酮高、中、低各剂量组小鼠的生存质量优于模型组、顺铂组和联合组。见图1。

与模型组比较，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组，顺铂组和联合组小鼠的肿瘤体积均较低，但仍呈逐渐上升趋势。第16天前，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组小鼠肿瘤体积增长速度基本一致，第16天之后，苏铁总黄酮高剂量组和中剂量组小鼠肿瘤体积急剧增长，但仍低于模型组小鼠肿瘤体积的增长速度，提示苏铁总黄酮对小鼠Lewis肺癌具有一定的抑制作用；顺铂组和联合组小鼠肿瘤体积增长速度缓慢，顺铂组小鼠肿瘤体积增长尤为缓慢，提示顺铂对小鼠Lewis肺癌具有较好的抑制作用。见图2。

图1 各给药组对Lewis肺癌模型小鼠生长的体质量变化曲线图(n=10)Fig.1 Weight change curve of each dose group on growth of model mice with Lewis lung cancer(n=10)

与模型组比较，苏铁高、中、低各剂量组、顺铂组和联合组小鼠瘤质量均降低，差异具有极显著意义(P<0.01)；与顺铂组和联合组比较，其他各组有极显著性差异(P<0.01)；与苏铁总黄酮高剂量组比较，苏铁总黄酮中剂量组无显著性差异，其他各组有极显著性差异(P<0.01)；与苏铁总黄酮中剂量组比较，苏铁总黄酮高剂量组和总剂量组无显著性差异，其他各组有极显著性差异(P<0.01)，各给药组均表现出一定程度的抑制肿瘤生长的作用，顺铂组的抑瘤率最高，但其体重却最轻，联合组次之，其体重接近模型组肿瘤小鼠的体重，这可能提示苏铁总黄酮联合顺铂给药在一定程度上具有保效减毒的作用。见图3、4。

图2 各给药组对Lewis肺癌模型小鼠生长的肿瘤体积变化曲线图(n=10)Fig.2 Tumor volume change curve of each dose group on growth of model mice with Lewis lung cancer(n=10)

图3 各给药组对Lewis肺癌模型小鼠瘤质量的影响Fig.3 Effect of each dose group on tumor mass of model mice with Lewis lung cancerNote: n=10,*.P<0.01，vs model group;△.P<0.01，vs cisplatinum group;#.P<0.01，vs combination group.

表1 各给药组对Lewis肺癌模型小鼠肺癌转移情况的影响

Tab.1 Effect of each dose group on lung tumor metastases of model mice with Lewis lung cancer

GroupsnTransfernumberTransferrate(%)NumberofmetastaticfociH10660．0013M12758．3310L12541．6714S10440．009C12433．338Model121083．3321

图4 各给药组对Lewis肺癌模型小鼠的抑瘤率(n=10)Fig.4 Inhibition rate of each dose group on model mice with Lewis lung cancer(n=10)

2.3 苏铁总黄酮对Lewis肺癌模型小鼠肺脏指数、脾脏指数、胸腺指数的影响 顺铂组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均低于模型组、空白对照组、苏铁总黄酮高、中、低各剂量组和联合组、提示注射用顺铂的毒副作用可能导致Lewis肺癌小鼠的免疫能力进一步降低；苏铁总黄酮高、中、低各剂量组的脾脏指数和胸腺指数明显增加，但其值仍低于空白对照组小鼠相关指数，提示苏铁总黄酮在一定程度上可以促进Lewis肺癌小鼠脾脏和胸腺的发育，增强其免疫能力；联合组脾脏指数和胸腺指数均大于模型组，这提示苏铁总黄酮联合顺铂给药在一定程度上起到增效减毒的作用。见图5。

2.4 苏铁总黄酮Lewis肺癌模型小鼠肿瘤转移的抑制作用 与模型组比较，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组、顺铂组和联合组小鼠的肺癌转移灶数及发生转移例数均减少，苏铁总黄酮低剂量组、顺铂组和联合组较苏铁总黄酮高剂量组和中剂量组显示出较强的抗肺癌侵袭转移的作用。见表1。

图5 各给药组对Lewis肺癌模型小鼠肺脏指数、脾脏指数和胸腺指数的影响Fig.5 Effect of each dose group on lung,spleen and thymus index of model mice with Lewis lung cancerNote: n=10,*.P<0.05，**.P<0.01，vs control group;△.P<0.05，△△.P<0.01，vs model group.

图6 各给药组对Lewis肺癌模型小鼠血清中IL-2、IL-10含量的影响Fig.6 Effect of each dose group on IL-2，IL-10 contents in serum of model mice with Lewis lung cancerNote: n=10,*.P<0.05，**.P<0.01 vs control group；△△.P<0.01 vs model group.

2.5 苏铁总黄酮对Lewis肺癌模型小鼠血清IL-2、IL-10的影响 与模型组比较，苏铁总黄酮高中低各剂量组、顺铂组和联合组的IL-2水平明显升高，而IL-10水平除了苏铁总黄酮中剂量组之外的其他各组均明显升高。与空白对照组比较，苏铁总黄酮高中低各剂量组、顺铂组和联合组的IL-10水平明显升高，而IL-2水平除了苏铁总黄酮高剂量组和联合组之外的其他各组均低于空白对照组。见图6。

3 讨论

苏铁，又名铁树、凤尾蕉、凤尾铁、凤尾松。苏铁有“植物界的大熊猫”之称[3,4]，性味甘、平、涩，有小毒[9]。傣药记载其根可用于解毒、收敛、通经、健胃、止咳、祛瘀[10]。民间验方记载其与半边莲、白花蛇舌草、红枣的水煎剂可用于治疗多种肿瘤。孙玲玲等[11]研究发现铁树叶提取液对K564和HL-60细胞增殖具有明显的抑制作用，其抑制作用可能与铁树叶中的苏铁甙、新苏铁甙A、新苏铁甙B以及苏铁双黄酮等苏铁毒甙类成分有关[11,12]，这为临床上用铁树叶治疗白血病奠定了一定的理论基础。孔繁翠等[13]的研究结果表明铁树提取物能明显诱导A549细胞凋亡，其作用机制可能是改变与凋亡相关基因的表达。迄今为止，有关苏铁抗肿瘤的研究主要集中在体外实验上，而在体实验报道较少，本实验通过建立Lewis肺癌模型小鼠，探讨苏铁总黄酮对苏铁总黄酮对Lewis肺癌模型小鼠的抑制作用及免疫功能的影响。

肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能有关，在关于肺癌的研究中，肺癌患者的免疫功能受到损害，特别是与免疫有关的Th1/Th2类细胞因子。Th1细胞主要分泌IL-2、IL-15、TNF等因子，主宰机体的细胞免疫，Th2细胞主要分泌IL-10、IL-4、IL-3等因子[14]，主宰机体的体液免疫。其中作为机体免疫调节中最重要的细胞因子之一的IL-2能刺激T细胞的生长与分化， 激活自然杀伤细胞、巨噬细胞等，促进CTL的功能，进而杀灭肿瘤细胞。IL-10是一种抑制细胞因子合成的因子，促进Th2分化并抑制Th1分化，而促进肿瘤细胞由Th2向Th1逆转将为肿瘤的免疫治疗提供新的途径[14,15]。

本实验结果显示，与模型组比较，只有苏铁总黄酮中剂量组IL-2水平明显升高，IL-10水平明显降低，说明苏铁总黄酮中剂量组可以促使机体的免疫细胞由Th2向Th1型逆转而发挥抗肿瘤作用。此外，苏铁总黄酮高、中、低各剂量组的瘤质量、肺转移灶数均低于模型组，提示苏铁总黄酮对肿瘤的生长转移具有一定的抑制作用。苏铁总黄酮高、中、低各剂量组的脾脏指数和胸腺指数明显增加，但其值仍低于空白对照组小鼠相关指数，提示苏铁总黄酮在一定程度上可以促进Lewis肺癌模型小鼠脾脏和胸腺的发育，增强其免疫能力，联合组脾脏指数和胸腺指数均大于模型组，这提示苏铁总黄酮联合顺铂给药在一定程度上起到增效减毒的作用。

综上所述，苏铁总黄酮可以抑制Lewis肺癌模型小鼠肿瘤细胞的生长、降低肺转移灶数目及增强其自身的免疫功能，其抗肿瘤的作用机制可能与调节Th1/Th2相关细胞因子的表达有关，而苏铁总黄酮的抗肿瘤作用机制值得进一步深入研究。

[1] Chatenoud L,Bertucciol P,Bosettil C,etal.Trends in mortality from major cancers in the Americas:1980-2010[J].Ann Oncol,2014,25(9):1843-1853.

[2] Chen WQ,Zheng RS,Zhang SW,etal.Report of cancer incidence and mortality in China,2010[J].Ann Transl Med,2014,2(7):61.

[3] 傅瑞树.苏铁(Cycas revoluta)研究的现状及展望[J].武夷科学,2000,16:187-190.

[4] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,1979:491-492.

[5] Moawad A,Hetta M,Zjawiony JK,etal.Two new dihydroamen-toflavone glycosides from Cycas revolute[J].Nat Prod Res,2014,28(1):41-47.

[6] Moawad A,Hetta M,Zjawiony JK,etal.Phytochemical inves-tigation of Cycas circinalis and Cycas revolute leaflets:moderately active antibacterial biflavonoids[J].Planta Med,2010,76(8):796-802.

[7] 张 琼.漫话铁树[J].中学生物学,2004,20(5):6.

[8] 李 欣,付海英,张佳伦,等.Lewis肺癌细胞通过TLR9对CD4+CD25+Treg细胞影响的研究[J].中国免疫学杂志,2010,26(2):124-128.

[9] Kowalska MT,Itzhak Y,Puett D.Presence of aromatase inhibitors in cycads[J].J Ethnopharmacol,1995,47(3):113-116.

[10] 贾敏茹,李星炜.中国民族药志要[M].北京:中国医药科技出版社,2005:114.

[11] 孙玲玲,毕富勇,凌烈峰,等.铁树叶提取液对白血病细胞株K562、HL-60增殖抑制作用的实验研究[J].九江医学,2001,16(4):192-193.

[12] 冉先德.中华药海[M].哈尔滨:哈尔滨出版社,1993:1465.

[13] 孔繁翠,顾 昊,王鹤尧,等.铁树提取物对人肺腺癌细胞凋亡的诱导及相关机制的初步研究[J].中国新药杂志,2008,17(8):667-672.

[14] 岳丽敏,秦峻岭,王春芳.Th1/Th2平衡在结核分枝杆菌免疫中的研究进展[J].中国免疫学杂志,2015,31(10):1426-1429.

[15] 何 维.医学免疫学[M].第2版.北京：人民卫生出版社,2010:414.

[收稿2015-11-16 修回2015-12-03]

(编辑 许四平)

Effects of total flavonoids from Cycas Revolute on inhibition and immune function of model mice with Lewis lung cancer

WANG Shao-Hui,LIU Tong-Xiang.

Institute of Chinese Minority Traditional Medicine,Minzu University of China,Beijing 100081,China

Objective:To explore the inhibition effect of total flavonoids from Cycas Revolute on the model mice with Lewis lung cancer,and its impacts on the immune function of tumor-bearing mice.Methods: 84 successful tumor-bearing mice were selected and then randomly divided into seven groups:model group,control group,high-dose group,medium-dose group,low-dose group,cisplatinum group,and combination group,12 mice in each group.Drug intervention for 14 days respectively,on the fifteenth day,pick the eyeball method for blood,use conventional methods to strip tumor tissues,lung,spleen and thymus and weight them,then calculate the inhibition rate,lung index,spleen index and thymus index.Using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the IL-2 and IL-10 leves in serum.Results: Compared with the model group,the tumor weight of the mice from the high-dose group,medium-dose group,low-dose group,cisplatinum group,and combination group were decreased.The difference was highly significant (P<0.01).The spleen index and thymus index of the high-dose group,medium-dose group and low-dose group were significantly increased,and far higher than the cisplatinum group and combination group.The ELISA results showed that compared with the model group,the IL-2 levels of the high-dose group,medium-dose group,low-dose group,cisplatinum group and combination group were significantly increased,and the IL-10 levels were significantly higher than the other groups in addition to the medium-dose group.Conclusion: The total flavonoids from Cycas Revolute may modulate the expression level of the IL-2 and IL-10,inhibit the growth and metastasis of the model mice with Lewis lung cancer and improve the immune function.

Total flavonoids from Cycas Revolute；Lewis lung cancer；Lung index；Spleen index；Thymus index；Immune function

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.007

①本文为中央民族大学大学生创新创业训练计划资助项目(GCYS2016110001)。

王绍辉(1990年-)，男，在读博士，主要从事肿瘤新药的研究与开发工作，E-mail: 860848015@qq.com。

及指导教师：刘同祥(1968年-)，男，博士，教授，研究员，博士生导师，主要从事民族药物资源与民族药新药研究开发工作，E-mail:tongxliu123@hotmail.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)11-1598-05