郑茂东，颜 娟，王爱萍，赵秀花，徐今宁

（河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000）

锌离子对灯盏花素与溶菌酶相互作用的影响

郑茂东，颜 娟，王爱萍，赵秀花，徐今宁

（河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000）

目的 在模拟人体生理条件下，研究Zn2＋对灯盏花素与溶菌酶相互作用的影响。方法 采用紫外光谱法、荧光光谱法研究Zn2＋对灯盏花素与溶菌酶相互作用机制、作用力类型的影响。结果 有无Zn2＋存在，灯盏花素与溶菌酶的荧光猝灭机制均为静态猝灭和非辐射能量转移；灯盏花素与溶菌酶的结合常数(K)分别为1．24×106L／mol和1．08×106L／mol，结合位点数(n)分别为1．05和1．19，结合距离(r)分别为1．96 nm和2．05 nm，其作用力均以疏水作用为主。结论 Zn2＋不改变灯盏花素与溶菌酶的作用机制，但能使两者结合的结合常数、结合距离、结合位点数发生改变。

锌离子；灯盏花素；溶菌酶；荧光光谱法

溶菌酶（LYSO）是一种广泛存在于生物体内的小分子碱性蛋白，能与许多内源性、外源性物质结合，具有抗菌、消炎、抗病毒等生物功能[1]。溶菌酶是药物发挥药效的一种重要载体，常被用作研究药物小分子与蛋白相互作用的模型蛋白，为研究药物在体内的分布、药效的发挥提供依据。灯盏花素（BR）是从中药灯盏花中提取的黄酮类有效成分，其主要有效成分灯盏乙素是一种黄酮苷类化合物，具有扩张脑血管、增加脑血流量等作用[2]。锌为人类机体必需的、具有重要生理功能的微量元素，在生物体内与蛋白质相互结合并被转运的过程中，可能会对其他小分子物质与蛋白质的相互作用过程产生影响[3]。本研究中采用紫外光谱法和荧光光谱法，在模拟人体生理条件下，研究Zn2＋对BR与溶菌酶相互作用的影响，并探讨其猝灭机制，得出有无Zn2＋存在时两者的结合常数、结合位点数、结合距离。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 仪器与试药

荧光光度计（Peltier电子恒温装置，美国Varian公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；TU－1901型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pHS－3C型数字酸度计（上海雷磁仪器厂）。缓冲溶液选择0．02mol／L的Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液（pH＝7．40，内含0．15mol／L的NaCl，其离子强度接近人体生理条件）；灯盏花素（昆明龙津药业股份有限公司，批号为20140512－1），配制成1．08×10－4mol／L的贮备液；溶菌酶（美国sigma公司），配制成1．05×10－4mol／L的贮备液；其他试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。1．2 试验方法

移取1．05×10－6mol／L溶菌酶溶液2．0m L，置1 cm石英池中，用可调式移液器逐次加入定量的BR和BR－Zn2＋溶液，混合均匀，分别在298，303，308 K温度下，以280 nm为激发波长，记录290～500 nm波长范围内的荧光光谱。

2 结果

2．1 荧光光谱

溶菌酶分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基而能发射较强的内源荧光，因而溶菌酶是内源性荧光物质。由图1可见，固定溶菌酶浓度时，荧光发射光谱随BR或BR－Zn2＋浓度的变化而变化。随着BR浓度的增加，溶菌酶荧光发射峰的强度有规律地降低，同时伴随着峰位蓝移，说明BR能与溶菌酶结合并猝灭其内源性荧光；此外，随着BR的加入，溶菌酶的色氨酸残基周围环境极性减弱、疏水性增强。加入Zn2＋前后，溶菌酶的峰形未发生明显变化，但猝灭程度和蓝移效果明显增大。由此表明，Zn2＋的存在对BR与溶菌酶的结合产生了显著影响，可能导致溶菌酶肽链进一步卷曲折叠，使其内部的疏水结构加强，从而增强色氨酸残基周围的疏水性[4]。

图1 308 K时灯盏花素对溶菌酶荧光猝灭图

2．2 荧光猝灭机制

引起溶菌酶荧光猝灭的原因有动态猝灭和静态猝灭作用2种。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子因扩散和碰撞导致荧光物质减弱的过程，假设BR对溶菌酶荧光的猝灭为动态猝灭，其猝灭过程应遵循 Stern－Volmer方程[5]：

其中，F0和 F分别为溶菌酶和BR作用前后的荧光强度，[Q]为BR的浓度，KSV为Stern－Volmer动态猝灭常数（L／mol），Kq为双分子动态猝灭速率常数[L／（mol·s）]，τ0为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命。

按照试验方法分别测定298，303，308 K时BR对溶菌酶的荧光猝灭光谱，结果见表1。

表1 灯盏花素与溶菌酶作用的相关参数

生物大分子荧光平均寿命大约为10～8s，各类猝灭剂对生物大分子最大碰撞猝灭常数为2．0×1010L／（mol·s），BR与溶菌酶作用的荧光猝灭速率常数 Kq远大于此最大值，初步判断此过程是静态猝灭；同时，随温度的升高，BR与溶菌酶作用的猝灭速率常数降低。由此进一步证实，BR与溶菌酶的荧光猝灭不是由于分子碰撞引起的动态猝灭，而是由BR与溶菌酶形成复合物而引起的静态猝灭。Zn2＋存在时，BR对溶菌酶的猝灭程度增加，但猝灭类型没有发生改变，仍为静态猝灭。

2．3 结合常数(K)和结合位点数(n)

对于静态猝灭，结合常数和结合位点数可由公式2计算得到[6]：

以lg（F0－F）／F对lg[Q]作图，根据直线的斜率和截距求出BR和BR－Zn2＋与溶菌酶相应的结合常数(K)和结合位点数(n)，结果见表1。可见，Zn2＋存在时，BR与溶菌酶的结合常数增加，n都约等于1，表明Zn2＋参与了BR与溶菌酶的作用。K增加可能是Zn2＋先与BR结合形成配合物，再与溶菌酶分子结合形成三元配合物。从临床医学和药学2个角度考虑，此过程Zn2＋的参与降低了BR的游离浓度，即增强了BR与溶菌酶的结合作用，使BR在血浆中的贮留时间相应延长，药物释放更缓慢，药物疗效更持久，有利于药物持久缓释发挥药效。

2．4 与溶菌酶色氨酸残基间的距离

根据Föster偶极－偶极非辐射能量转移理论，如果供体的荧光光谱与受体的紫外光谱有足够的重叠，且两者之间的距离小于7nm，可判定供体与受体之间可能发生非辐射能量转移，导致荧光猝灭。结合BR和BR－Zn2＋的紫外吸收光谱和溶菌酶的荧光光谱的叠加图[7]，求得供体和受体之间的距离 r分别为2．05 nm和1．96 nm。BR与溶菌酶足够靠近（r＜7 nm），可推断BR与溶菌酶发生了非辐射能量转移而使溶菌酶发生荧光猝灭。Zn2＋存在时，BR与溶菌酶的猝灭类型未发生改变，但与溶菌酶色氨酸残基的距离发生了一定改变。

2．5 与溶菌酶结合的热力学性质

分子间的作用力主要包括范德华力、疏水作用力、氢键、静电引力等[8]。分别测定在298，303，308 K下BR和BR－Zn2＋与溶菌酶作用的相关热力学参数，结果见表2。

表2 BR与溶菌酶相互作用的热力学参数

根据热力学参数与作用力的关系[9]，ΔrHm＞0，Δr Sm＞0，可判定BR与溶菌酶作用力为典型的疏水作用。Zn2＋存在下，ΔrHm＞0，Δr Sm＞0，说明 Zn2＋的存在未改变BR与溶菌酶的作用力类型仍以疏水作用为主。

3 讨论

人体内含有多种微量金属离子，共同参与各种生命活动，能与药物发生相互作用，与酶蛋白结合发挥独特作用。由本研究结果可见，Zn2＋的存在，增大了BR与溶菌酶的结合常数，推测由于Zn2＋能与BR生成络合物再与溶菌酶作用形成新的复合物；Zn2＋同时与BR和溶菌酶结合，在药物与溶菌酶之间形成“离子架桥”，从而增强了BR与溶菌酶的结合常数。结合常数的增大，有利于BR在血浆中的贮存，有利于增加其在体内的作用时间，可对提高其药效提供理论依据。

[1]Zhang HM，Xu YQ，Zhou QH，etal．Investigation of the interaction tween chlorophenols and lysozyme in solution[J]．Journal of Photochemistryand Photobiology B：Biology，2011，104（3）：405－413．

[2]钟海军，邓英杰，徐春莲，等．灯盏花素的理化性质研究[J]．中国药房，2013，24（7）：608－610．

[3]郭 明，刘咪咪，李铭慧，等．亲和毛细管电泳法研究锌离子与人血清白蛋白的结合反应机制[J]．分析化学，2012，40（2）：268－272．

[4]蒋新宇，李文秀，陈景文．锌离子存在下槲皮素、杨梅素与牛血清蛋白的结合[J]．无机化学学报，2008，24（10）：1 588－1 595．

[5]杨 频，高 飞．生物无机化学原理[M]．北京：科学出版社，2002：322．

[6]宋志英，韩 冬，王 娟，等．四种呋喃香豆素类药物与溶菌酶的作用机制及构效关系研究[J]．分析测试学报，2013，27（1）：23－31．

[7]郑茂东，杨锦艳，郝 娟，等．中药成分五味子甲素及其金属离子复合物与血清白蛋白相互作用的研究[J]．分析科学学报，2010，26（4）：400－404．

[8]Ross PD，Subramanian S．Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability[J]．Biochemistry，1981，20（11）：3 096－3 102．

[9]董 露，易忠胜，伍智蔚，等．2′－羟基－2，4－二溴二苯醚与人血清白蛋白作用机制的光谱研究与计算模拟[J]．高等学校化学学报，2015，29（3）：516－522．

Effect of Zinc Iron on Interaction between Breviscapine and Lysozym e

Zheng Maodong，Yan Juan，Wang Aiping，Zhao Xiuhua，Xu Jinning
（The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei，China 075000）

Objective To study the effect of Zn2＋on the interaction between breviscapine and lysozyme under the simulative human physiological condition．M ethods The interaction between breviscapine with lysozyme，with or without Zn2＋was investigated using ultraviolet spectroscopy and fluorescence spectroscopy．Resu lts The results of fluorescence spectrometry showed that the endogenous fluorescence of lysozyme had been significantly quenched by breviscapine of fluorescence quenching were static quenching with non－radiation energy transfer．The binding parameters of breviscapine and lysozyme were as follows：with or without Zn2＋，the binding constants K were 1．24×106L／mol，1．08×106L／mol，the numbers of binding site were 1．05，1．19，binding distances were 1．96 nm，2．05 nm respectively．And the major driving force was hydrophobic force．Conclusion The results shows that the presence of Zn2＋does not affect the quenching mechanism，but changes the binding constants，the numbers of binding site and the binding distances．

Zn2＋；breviscapine；lysozyme；fluorescence spectrometry

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2016)04－0024－03

郑茂东（1982－），男，硕士研究生，主管药师，研究方向为药物与生物大分子相互作用，（电子信箱）zhengmd520＠126．com。

2015－10－14)

河北省自然科学基金资助项目，项目编号：H4014405031；河北省卫生厅资助项目，项目编号：ZD20140167；河北省张家口市科技局资助项目，项目编号：1421132D。