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(1.南华大学药物药理研究所，湖南省分子靶标新药研究协同创新中心,湖南 衡阳，421001，2.中国中药有限公司)

·基础医学·

黑骨藤追风活络胶囊抗类风湿性关节炎的药理作用及机制

骆镜妃1，胡宗科2，邓康2，张瑶1，彭莎莎1，洪陈亮1，王珍1，杨丽1，曾中三1，秦旭平1*

(1.南华大学药物药理研究所，湖南省分子靶标新药研究协同创新中心,湖南 衡阳，421001，2.中国中药有限公司)

目的探讨苗药黑骨藤追风活络胶囊的抗类风湿关节炎的药理作用及机制。方法将雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只分为正常SD大鼠10只正常为对照组，另40只建立关节炎大鼠后分为模型非给药组、黑骨藤追风活络胶囊组(给予黑骨藤追风活络胶囊)、两种阳性药物对照组(分别以强的松及吲哚美辛治疗)，每组10只；观察黑骨藤追风活络胶囊对关节炎大鼠足肿胀、脏器指数，以及血浆、关节液中白细胞介素(IL)-1β、白介素-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症因子水平的影响。结果与正常对照组相比较，关节炎模型组大鼠足肿胀程度逐渐增加，胸腺、脾脏、肾上腺和肾脏指数增加(P<0.05)；同时，关节炎大鼠血浆、关节液中IL-1β、IL-10、TNF-α等炎症因子水平明显升高。给予药物黑骨藤追风活络胶囊治疗后，足肿胀程度、胸腺和脾脏指数显著降低(P<0.05)，肾上腺、肾脏指数无明显改善，效果与强的松、吲哚美辛对照药组相当。炎症因子IL-1β、TNF-α水平在药物治疗组显著降低(P<0.05)，但IL-10水平较给药后有进一步升高。结论黑骨藤追风活络胶囊能够起到抗风湿性关节炎的作用，其作用机制可能与调节免疫器官功能有关。

黑骨藤追风活络胶囊； 风湿性关节炎； 炎症因子； 药理作用

类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，患者临床表现主要为关节肿胀、疼痛，严重影响患者健康和生活。对类风湿性关节炎的临床治疗，现今仍然是以非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs)和皮质激素为主，这些药物在很大程度上可以改善病情，缓解症状，但是长期服用将引起许多不良反应，如NSAIDs的胃肠道反应和肾毒性，增加感染的易感性、引起消化道溃疡等[1-2]。黑骨藤追风活络胶囊是由苗族民间三味中草药黑骨藤、追风伞和青风藤制成的复方制剂，其治疗风湿患者有效率超过90%[3]。目前认为该胶囊，具有活血化瘀、祛风除湿的作用，但在风湿性关节炎患者中的药理作用及其分子机制尚不完全清楚。由于类风湿大鼠的关节组织病理学、血液中各项因子变化状况与人体类风湿病理状态下的相似度非常高[4]，为此，本研究选择大鼠为实验对象，对苗药黑骨藤追风活络胶囊的抗类风湿关节炎的作用以及相关分子机制进行研究。

1 材料与方法

1.1实验动物与药品购买南华大学动物中心清洁级雄性Wister大鼠50只，体重平均 185.2±13.7 g，在实验室适应饲养一周，饲养条件为光照和黑暗各为12 h。黑骨藤追风活络胶囊(贵州国药集团老来福药业有限公司，批号：20140205)规格为 0.3 g /粒，阳性对照药醋酸泼尼松片(强的松)(辰欣药业股份有限公司，批号:国药准字 150820203，规格 5 mg×100片)，吲哚美辛(山西太原药业有限公司，批号：150201，规格：25 mg×100片)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)由成都市科龙化工试剂厂生产。

1.2动物模型及分组将50只SD大鼠分为正常对照组10只，另40只参考文献[4-5]方法制备类风湿性关节炎大鼠模型，即使用无水羊毛脂、液体石蜡和卡介苗制备完全佐剂，将Ⅱ型胶原溶液溶解在0.01 mL/L的乙酸中，制备成浓度为4 mg/mL的溶液，搅拌后过夜放置。将搅拌好的Ⅱ型胶原乙酸溶液按照1∶1比例滴入到佐剂中，完全乳化。模型组大鼠的左后足底、尾根、背部注射乳化液，7天后再次注射，当大鼠四肢足爪严重肿胀、关节增大直径幅度超过2 mm时为造模成功。正常对照组为正常大鼠予以正常生理盐水注射，然后给予0.5% CMC-Na灌胃治疗。另40只造模成功的大鼠分为4组：模型非给药组(0.5% CMC-Na治疗)、阳性对照药强的松(醋酸泼尼松，29.2 mg/kg)组；吲哚美辛组(12.5 mg/kg)，黑骨藤追风活络胶囊组(HGF,27 g/kg)，每组10只(n=10)。

1.3给药方法所有药物按10倍于60 kg 人体重折算为大鼠等效剂量[6]，用0.5% CMC-Na配成混悬液，根据大鼠体重选择每日药物剂量 (相当人类剂量10倍)，分两次给药，连续21天。正常组和模型组灌胃等体积的0.5%CMC-Na。以上各组给药体积相等。

1.4疗效指标测定

1.4.1 足肿胀度测量 用大鼠足容积测量仪(自制)，实验第1天,用记号笔在大鼠后肢踝关节周围作上记号，并拉直放入足容积测量仪装置内,使足标记与其刻度相平,测量并记录每只大鼠未造模前左后足容积(mL)。随后，测定正常对照组和造模后给药和非给药组第4、8、16、21天大鼠左足容积，计算足肿胀度。足肿胀度=(注射佐剂后容积-注射佐剂前容积)/ 注射佐剂前容积×100%。

1.4.2 大鼠脏器指数测算 最后一次给药后处死所有大鼠，称体重，取出胸腺、肾上腺、脾、肾等脏器，称量结果，计算脏器指数。脏器指数=脏器湿重量/体重×100%。

1.4.3 血清和组织液的制备 样本的制备参考文献[4]的方法，取造模第 21 天，末次给药后的股动脉取血，放置，离心，取上清液，在 -20 ℃ 下保存待测。关节液的提取，处死大鼠后，在致炎侧关节上方0.5 cm处取出肿胀部分，纵向切开，放入 5 mL 生理盐水的试管中 4 ℃ 浸泡过夜，离心，取上清液，在-20 ℃下保存待测。

1.4.4 血清和关节液中IL-1β，IL-10，TNF-α 的含量测定 IL-1β、IL-10 和肿瘤坏死因子(TNF)-α，采用ELESA试剂盒(上海太阳生物技术公司)进行测量。用抗大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IL-1β、IL-10、TNF-α形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 与生物素结合，加入酶底物 OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在 492 nm 处可测得吸光值(OD 值)，大鼠血中的IL-1β、IL-10、TNF-α浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中大鼠血清和关节液中IL-1β，IL-10，TNF-α浓度。具体步骤按试剂盒操作说明进行。

2 结 果

2.1足肿胀程度注射佐剂后，模型组大鼠足肿胀逐渐增加，于造模后第8天到达高峰，之后开始下降，与正常对照组比较差异有显著性(P<0.01)。与正常对照组比较，药物治疗组足肿胀程度逐渐降低(P<0.05)。与其他药物治疗组(强的松组、吲哚美辛组)相比，在第21天黑骨藤追风活络胶囊组的抗炎作用最为明显，差异有显著性(P<0.05，详见表1)。

表1大鼠足肿胀测量结果(%)

组别第4天第8天第16天第21天正常对照组0．056±0．0130．081±0．0．120．115±0．0180．191±0．014模型非给药组1．126±0．251a1．253±0．412a1．175±0．198a1．204±0．217a吲哚美辛组0．941±0．023b0．814±0．053b0．808±0．0196b0．742±0．066b强的松组1．132±0．027b1．127±0．046b0．942±0．123b0．908±0．025b黑骨藤追风活络胶囊组1．024±0．054b0．802±0．049b0．785±0．047b0．615±0．132bc

与正常对照组比较，a:P<0.01;与模型非给药组比较，b:P<0.05；与强的松或吲哚美辛组比较，c:P<0.05

2.2大鼠脏器指数与正常对照组相比，模型组大鼠胸腺、肾上腺、肾脏、脾脏指数明显升高(P<0.01)。与模型组比较，黑骨藤追风活络胶囊能显著降低胸腺和脾脏指数(P<0.05)，而升高肾上腺和肾脏指数(P<0.05)；其余药物治疗组作用相对较低。见表2。

2.3炎症因子表达ELISA试剂盒测量大鼠血清和关节液中IL-1β、IL-10、TNF-α水平发现，与正常对照组相比，模型非给药组IL-1β、IL-10、TNF-α水平在血液和关节液中都有明显升高，药物治疗组能降低两种组织中IL-1β、TNF-α的水平，但对IL-10水平不同药物作用不同。黑骨藤追风活络胶囊与吲哚美辛组IL-10水平较有升高，强的松治疗组IL-10水平相对降低(表3)。

表2大鼠脏器指数的比较

组别胸腺肾上腺肾脏脾脏正常对照组1．32±0．270．11±0．0055．41±0．272．26±0．48模型非给药组1．58±0．24a0．17±0．041a7．02±0．41a3．37±0．28a吲哚美辛组1．36±0．41b0．21±0．024b7．52±0．41b2．71±0．20b强的松组1．42±0．31b0．15±0．0717．04±0．423．27±0．42黑骨藤追风活络胶囊组1．31±0．14b0．27±0．016b8．25±0．33b2．89±0．27b

与正常对照组比较，a:P<0.01;与模型非给药组比较，b:P<0.05

表3大鼠血浆和滑膜组织中IL-1β、IL-10、TNF-α浓度(μg/L)

组别血清IL⁃1βIL⁃10TNF⁃α关节液IL⁃1βIL⁃10TNF⁃α正常对照组0．601±0．1370．116±0．0150．412±0．0320．451±0．1120．089±0．0250．322±0．022模型非给药组1．18±0．204a0．217±0．043a0．725±0．024a0．918±0．104a0．117±0．033a0．612±0．014a吲哚美辛组0．66±0．41b0．221±0．024b0．520±0．41b0．526±0．014b0．123±0．034b0．320±0．211b强的松组0．720±0．31b0．153±0．021b0．503±0．012b0．612±0．231b0．095±0．011b0．412±0．022b黑骨藤追风活络胶囊组0．391±0．131b0．401±0．076b0．315±0．023b0．301±0．083b0．310±0．056b0．228±0．025b

与正常对照组比较，a:P<0.01;与模型非给药组比较，b:P<0.05

3 讨 论

黑骨藤追风活络胶囊中的主要物质为黑骨藤、青风藤、追风伞，在苗医中具有抬奥、抬蒙(祛风除湿,消肿止痛)，用于治疗僵见风。本结果显示：大鼠注射佐剂后，足趾关节持续肿胀，关节变大，说明关节炎模型成功。给予黑骨藤追风活络胶囊治疗后，大鼠足肿胀程度明显降低，初步证实黑骨藤追风活络胶囊能够对类风湿关节炎起到一定的防治作用。

类风湿性疾病与免疫因素有关，体内过强的免疫激活能损伤正常组织引起组织炎症。胸腺、脾脏是体内重要的免疫脏器，脏器相对质量的变化就是脏器指数，脏器指数在免疫评价中有着非常重要的意义，其能够对动物免疫功能进行评估，也是临床中最常用、最基本的评估指标[5]。本文结果显示：模型组大鼠胸腺和脾脏指数明显升高，说明在炎症应激时，大鼠体内免疫脏器激活。给予黑骨藤追风活络胶囊治疗后，关节炎症明显减轻，同时胸腺和脾脏指数也明显降低，这与强的松、吲哚美新组相似。说明黑骨藤追风活络胶囊的抗炎作用与抑制免疫炎症和非特异性炎症有关。因为吲哚美新的抗炎作用主要与抑制体内前列腺素的合成，而强的松主要通过白三烯等炎症介质和降低白细胞活性等机制抑制炎症反应。因此，可以认为，黑骨藤追风活络胶囊能够通过调节免疫器官的功能，起到抗类风湿的作用，达到治疗效果。本研究结果也与黑骨藤追风活络胶囊主要成分黑骨藤的实验结果类似[7-9]，本实验发现，黑骨藤追风活络胶囊组大鼠的肾脏指数增大，提示黑骨藤追风活络胶囊对肾脏和肝脏可能也有一定的毒副作用。

大量炎症因子参与类风湿性免疫炎症的反应[10]，间质类风湿关节炎的滑膜病变时，关节囊内巨噬细胞受刺激后活化并分泌IL-1，使局部组织间质细胞分泌大量的前列腺素和胶原酶，分解坏滑膜。IL-10是一种多功能负性调节因子，主要由Th2细胞、活化的B细胞、单核细胞、巨噬细胞产生。IL-10在自身免疫性疾病类风湿性关节炎中表达上调主要是由于免疫功能失调导致机体对细胞免疫和体液免疫的高敏感性。在胶原诱导关节炎模型中检测到IL-10水平升高，中和IL-10后关节炎加重，给予IL-10治疗能明显抑制关节的炎症，提示在类风湿性关节炎的发病中IL-10具体有很强免疫抑制及免疫调控作用。

TNF-α是机体炎症反应与免疫应答的重要调节因子，能刺激滑膜细胞和软骨细胞合成前列腺素E2和胶原酶，导致关节局部滑膜炎症和软骨组织破坏，也能刺激IL-1、IL-6、IL-8等其它炎症因子的产生，在类风湿性关节炎局灶性骨侵蚀的发病机制中起重要作用[10]。

本实验结果也证实，黑骨藤追风活络胶囊能够降低风湿性关节炎大鼠血清和关节液中IL-1β、TNF-α水平，增加IL-10的水平，从而控制关节炎症反应。因此，可以进一步认为黑骨藤追风活络胶囊能够通过调节不同的免疫因子的分泌和释放减轻关节炎性反应，达到抗类风湿疾病的作用。随着现代医学研究方法的发展，进一步证明骨藤追风活络胶囊抗类风湿作用的机制可能为阐明该病的病理生理学机制和发现新药靶点提供重要的实验依据。

[1] 刘树成,邵惠玲,田宏.类风湿性关节炎的药物治疗[J].中国实用民药.2012,5(7):167-169.

[2] 张群,王竞秋.类风湿性关节炎发病机制与临床治疗的研究进展[J].内蒙古中医药.2013,21(3):148-149.

[3] 王和鸣,葛继荣,陈治英.黑骨藤追风活络胶囊治疗痹病的临床研究[J].中国中医骨伤科杂志，1999,7(2):12-14.

[4] 黄明进,罗春丽,郭刚,等.黑骨藤抗类风湿性关节炎作用及其分子机制[J].中国实验方剂学杂志，2011,17(12):174-177.

[5] 刘建文．药理实验方法学——新技术与新方法[M].北京：化学工业出版社，2003:6.

[6] 黄继汉,黄晓晖,陈志扬,等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学，2004,9(9):106-107.

[7] 吴荣荣,张晓锐,孙磊,等.黑骨藤活性部位抗炎与免疫调节作用研究[J].医药导报，2010,29(11);1425-1428.

[8] 张令令,肖智勇,马渊,等.苗药黑骨藤多糖部位HGT-5A的细胞免疫抑制作用及其可能的活性成分[J].中国药理学与毒理学杂志,2011,25(6):538-539.

[9] 梁江,马武开,刘正奇.黑骨藤乙醇提取物影响人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及COX-2、PGE-2表达的研究[J].时珍国医国药,2015,26(1):24-27.

[10] Gravallese EM,Goldring SR.Cellular mechanism and the role of cytokines in bone erosions in rheumatoid arthritis[J].ArthritisRheum,2000,43(10):2143-2151.

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.02.005

2015-11-10；

2016-02-26

湖南省分子靶标新药研究协同创新中心湘教通(2014)405号.

*通讯作者，E-mail:qinxp333@hotmail.com.

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