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(南华大学医学院临床技能中心，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

胶质瘤中Par6蛋白的表达及其临床病理学意义

徐刚，洪丽，蒋穗斌*

(南华大学医学院临床技能中心，湖南 衡阳 421001)

目的检测Partitioning defective 6(Par6)蛋白在胶质瘤组织中的表达，分析其临床病理学意义，探讨Par6基因在胶质瘤发生发展中的作用。方法收集70例不同临床分期及不同分化程度胶质瘤组织及20例正常脑组织标本，应用免疫组化检测Par6蛋白的表达。结果与正常脑组织相比，胶质瘤组织中Par6蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。Par6蛋白在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中的表达明显低于在Ⅰ、Ⅱ的胶质瘤。结论Par6蛋白在胶质瘤中低表达。其表达水平与胶质瘤的恶性程度密切相关。

胶质瘤； Par6； 侵袭； 临床分期

恶性胶质瘤是一种常见的恶性程度相当高的原发性脑瘤，占中枢神经系统肿瘤的50%以上。具有病程进展快，预后差的特点[1,2]。尽管在诊断方法和手术结合放、化疗的治疗策略上有了明显进步，但恶性胶质瘤的复发和5年生存率依然不容乐观[3]。因此，深入研究恶性胶质瘤发生发展的分子机制将有助于发现新的治疗靶点，为恶性胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路。

Par6蛋白是进化上高度保守的不对称分裂所需的蛋白质，能够与许多极性相关蛋白组成蛋白复合物，参与包括apical-basal细胞极性，细胞定向分化，细胞迁移，细胞增殖和神经元轴突分化等许多细胞生长发育过程[4]。近年来研究发现，Par6在乳腺癌、前列腺癌的Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT)进程中起到关键作用[5]。那么在以高度侵袭性为特点的恶性胶质瘤中，Par6的功能极其作用机制值得探索。

本研究通过生物信息学分析发现，在恶性程度最高的胶质母细胞瘤中，Par6表达明显下调。随后，免疫组化证实Par6在各级胶质瘤组织中表达均有不同程度下调。Par6的表达水平与恶性程度成反比。我们的实验提示Par6可以作为胶质瘤分子诊断的候选标志物，并成为胶质瘤治疗过程中的新靶点。

1 材料与方法

1.1生物信息学数据库GBM Gene expression (AgilentG4502A_07_1)源自The Cancer Genome Atlas(http://cancergenome.nih.gov)。数据处理使用cBioPortal和GraphPad Prism软件。

1.2主要组织标本和主要试剂正常脑组织样本20例，其中9例取自开颅血肿清除术的脑外伤患者，2例取自因手术部位较深必须切除部分脑组织的良性脑瘤患者，9例取自南华大学司法鉴定中心尸体解剖正常大脑组织。胶质瘤组织样本70例，其中病理分级Ⅰ级9例、Ⅱ级19例、Ⅲ级22例、Ⅳ级20例，以上胶质瘤组织样本均采集于中南大学湘雅一医院神经外科手术室，组织样本离体后立即放入液氮中保存。每例组织样本留取部分甲醛固定，石蜡包埋，HE 染色，并经中南大学湘雅一医院病理科再次确诊。上述所有组织样本的使用均获得中南大学和南华大学伦理委员会同意。

1.3 SP免疫组化检测胶质瘤组织中Par6蛋白的表达石蜡切片常规脱蜡至水，免疫组化操作步骤按试剂盒说明进行。3% H2O2孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶；10%枸橼酸盐缓冲液热修复抗原；PBS 清洗后正常羊血清封闭30 min；滴加50 μL鼠抗人Par6单克隆抗体(Santa Cruz，1∶100)，4 ℃孵育过夜；PBS清洗后滴加生物素化的羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗后经DAB 显色，镜下控制显色时间，苏木精复染，脱水，中性树胶封片。阴性对照以PBS代替一抗，每张切片至少随机观察5个高倍视野，综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。染色强度评分标准[6]:不着色0分,黄色1分,棕黄色2分，黄褐色3分。阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数<10%者0分，10%～40%者1分，40%～70% 者2分，≥70%者3分。两种评分相加0～70%者2分，≥70%者3分。两种评分相加0～2分为弱表达，3～6分为强表达。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件处理各组数据。计量数据用均数±标准差表示，组间比较行单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1生物信息学分析Par6在胶质母细胞瘤中的表达我们从癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)计划数据库的胶质母细胞瘤全基因表达图谱数据库中获得10例正常脑组织及16 383例胶质母细胞瘤组织的基因组测序结果，通过生物信息学数据分析发现，胶质母细胞瘤中的Par6表达水平明显低于正常脑组织，差异有显著性(图1)。

图1 TCGA数据库中胶质母细胞瘤的表达 Normal:正常脑组织，GBM：Glioblastoma Multiforme多形性胶质母细胞瘤。***:P<0.001

2.2胶质瘤组织Par6蛋白的免疫组化表达Par6阳性染色为棕黄色,位于胞浆(图2A～D)。结果显示，相对于正常脑组织，Par6在胶质瘤组织中表达明显下调(表1，图2C,D)。进一步分析Par6表达与临床病理特征，如表2所示，虽然Par6的表达水平与病人的年龄，性别以及病理组织学类型无显著相关性，但与胶质瘤临床分级显著相关(Ⅰ～Ⅱ vs Ⅲ～Ⅳ；P=0.008)。

图2 免疫组化SP法检测Par6蛋白在胶质瘤中的表达 A：正常脑组织(40×)；B：胶质瘤组织(40×)；C：正常脑组织(200×)；D：胶质瘤组织( 200×)

表1Par6蛋白在胶质瘤和正常脑组织中的表达

项目nPar6表达强表达弱表达P胶质瘤7025450．013正常脑组织20164-

表2胶质瘤中Par6蛋白表达与临床病理特征分析

项目nPar6表达强表达弱表达P性别男4613(28．3%)33(71．7%)0．114女2413(54．2%)11(45．8%)-年龄≥503616(44．4%)20(55．6%)0．326<503410(29．4%)24(70．6%)-组织学类型星形胶质细胞瘤5223(44．2%)29(55．8%)0．262少突胶质细胞瘤81(12．5%)7(87．5%)-其他104(40．0%)6(60．0%)-WHO分级Ⅰ+Ⅱ2414(58．3%)10(41．7%)0．008Ⅲ+Ⅳ4611(23．9%)35(76．1%)-

3 讨 论

Par6作为极性分化相关基因在线虫发育过程中被发现后，大量研究证实Par6蛋白位于极性蛋白交互作用网络中的核心位置，类似于一个港口，各种极性蛋白在此停靠，在Par6的参与下，组成Par6-Lgl-Scrb，Par6-Par3-cdc42-aPKCζ等极性蛋白复合共同参与细胞极性调控[7]。这些极性蛋白复合物的功能异常是肿瘤发生发展的关键因素之一[8]。本研究从TCGA数据库中发现，Par6基因在胶质母细胞瘤中表达明显下调，随后，我们证实Par6蛋白在各级胶质瘤中的表达均下调。虽然目前关于Par6表达下调的原因和机制尚未明确，但其在多种肿瘤中的表达异常提示Par6蛋白在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色。分析Par6表达与胶质瘤临床病理特征的关系，结果显示，Par6蛋白的表达水平与病人的年龄，性别及胶质瘤的病理分型无关，但与WHO分级显著相关，Par6蛋白在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中的表达明显低于在Ⅰ、Ⅱ的胶质瘤。脑胶质瘤是起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，具有极强的侵袭能力。由于Par6蛋白在细胞极性信号通路中起到至关重要重要的作用，而细胞的极性调控异常是肿瘤细胞侵袭转移能力的主要特征。其表达与胶质瘤恶性程度的负相关提示，Par6蛋白与胶质瘤的侵袭转移能力相关。

恶性胶质瘤系浸润性生长，与正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发。由于血脑屏障等因素的影响，化学药物和一般抗肿瘤的中药，疗效也不理想。因此，研究Par6在胶质瘤中的表达为胶质瘤的分子诊断及靶向治疗提供了新的候选靶点。

[1] Kang JH,Adamson C.Novel chemotherapeutics and other therapies for treating high-grade glioma[J].Expert Opin Investig Drugs,2015,24(10):1361-1379.

[2] Wang J,Su HK,Zhao HF,et al.Progress in the application of molecular biomarkers in gliomas[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,465(1):1-4.

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[5] Gunaratne A,Di Guglielmo GM.Par6 is phosphorylated by aPKC to facilitate EMT[J].Cell Adh Migr,2013,7(4):357-361.

[6] 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志,1996(4):229-231.

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TheExpressionandClinicalPathologicalSignificanceofPar6inGlioma

XU Gang,HONG Li,JIANG Suibing

(ClinicalTechnologyCenterofMedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang421001，China)

ObjectiveTo explore the role of Par6 in the development of glioma by analysis of the expression of Par6 in glioma tissue.Methods70 cases of human glioma tissue with different clinical period and differentiation histological type and 20 cases of normal brain tissue were selected.The protein of Par6 was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with normal brain tissue,the expression of Par6 protein in glioma tissue decreased significantly (P<0.05).The expression level of Par6 was lower at stage Ⅲ～Ⅳ than that at Ⅰ～Ⅱ (Ⅰ～ⅡvsⅢ～Ⅳ;P=0.008).ConclusionThe expression of Par6 in glioma tissue decreased,and Par6 was involved in the development and progression of glioma,which was markedly correlated with clinical stage.

Par6; Glioma; invasion; clinical stage

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.02.007

2015-09-21；

2015-11-09

*通讯作者，E-mail:jsb923@sina.com.

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秦旭平)