何 东

(嘉应学院 梅州师范分院，广东 梅州 514087)

实验技术



UPLC-MS/MS法测定冰淇淋与雪糕中3种季铵盐类化合物

何 东*

(嘉应学院 梅州师范分院，广东 梅州 514087)

基于固相萃取(SPE)技术和超高效液相色谱-质谱/质谱仪(UPLC-MS/MS)，建立了一种测定冰淇淋和雪糕中3种季铵盐消毒剂(十二烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基二甲基苄基氯化铵和苄索氯铵)残留量的方法。样品融化混匀后，用乙腈提取和沉淀蛋白，提取液经弱阳离子交换(WCX)固相萃取柱净化，氮吹浓缩后，采用亲水色谱柱(HILIC)在0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸铵流动相体系中等度分离，在质谱的电喷雾(ESI)离子源正模式和多反应监测(MRM)模式下测定。结果表明，3种季铵盐在0.5～20 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，方法的定量下限(S/N=10)为3.0～5.5 μg/kg，3个加标水平的平均回收率为90.7%～102.2%，相对标准偏差(RSD,n=6)为2.4%～6.4%。该方法简单，准确灵敏，重现性好，适用于冰淇淋和雪糕中3种季铵盐消毒剂的检测。

季铵盐；冰淇淋和雪糕；超高效液相色谱-质谱/质谱法(UPLC-MS/MS)；固相萃取(SPE)

季铵盐(Quaternary ammonium compounds)是铵离子中4个氢原子均被烃基取代的一类化合物，其性质与无机盐相似，易溶于水，具有良好的抑制或杀灭病原微生物的作用[1-3]，且使用方便、对人体毒性小、价格低，因此在食品工业中广泛用作消毒杀菌剂，如用于食品生产设备和容器的消毒杀菌等[4-5]。根据原卫生部印发的《食品用消毒剂原料(成份)名单(2009版)》，食品用季铵盐类消毒剂主要包括十二烷基二甲基苄基氯化铵(C12-BAC)和十六烷基二甲基苄基氯化铵(C16-BAC)等；欧盟等许多国家和地区也允许在食品工业中使用BAC。但盛装容器和生产设备上残存的消毒剂与食品接触后，会迁移和残留在食品中，给食品安全带来潜在风险。季铵类化合物对水生生物具有毒性，可以引起人类的哮喘、皮肤过敏性反应、视力减退等病症[6]，因此欧洲食品安全局规定该类消毒剂在食品中的残留上限为0.1 mg/kg[7]。我国尚未建立有关冰淇淋和雪糕中季铵盐类消毒剂残留的限值和检测国家标准，相关检测方法也鲜见报道。为有效了解冰淇淋和雪糕中季铵盐类消毒剂的残留情况，研究建立相关检测方法非常必要。

目前，国内外关于季铵盐类消毒剂的检测方法主要有紫外-可见分光光度法[8]、毛细管电泳法[9]、液相色谱法[10-11]、离子色谱法[12-13]、气相色谱-质谱法[14]和液相色谱-质谱/质谱法[1-2,15-16]。由于液相色谱-质谱/质谱仪具有较好的选择性和灵敏度，且可提供化合物确证的结构信息，已成为食品中痕量风险物质残留检测的主流仪器[17-18]。本研究采用超高效液相色谱-质谱/质谱仪(UPLC-MS/MS)结合固相萃取(SPE)净化技术，建立了冰淇淋和雪糕中C12-BAC,C16-BAC和苄索氯铵(Benzethonium chloride)残留的检测方法，可为相关标准制定或监控工作提供技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱和XevoTMTQ三重四极杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS，美国Waters公司)；MS3 basic旋涡混合器(德国IKA公司)；台式离心机(科大中佳公司)；Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)。Oasis WCX固相萃取柱(60 mg/3 mL，美国Waters公司)，临用前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化。

标准品：C12-BAC(CAS:139-07-1，纯度≥98.0%)、C16-BAC(CAS:122-18-9，纯度≥95.0%)、苄索氯铵(CAS:121-54-0，纯度≥95.0%)，均购于CNW Technologies公司。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵(色谱纯，美国Fisher公司)；氨水(分析纯，广州化学试剂厂)；实验用水为Milli-Q仪制备的去离子水(18.0 MΩ·cm)。

1.2 标准溶液的配制

分别称取适量的3种季铵盐标准品，用甲醇配成质量浓度均为100 mg/L的单标储备液；分别吸取适量3种单标储备液，用乙腈稀释成质量浓度均为1.0 mg/L的混合标准溶液。临用时，用乙腈配成质量浓度为0.5，1.0 ，2.0，5.0，10，20 μg/L的系列混合标准工作溶液。

1.3 样品处理

待冰淇淋或雪糕样品融化混匀后，称取1.0 g试样于10 mL玻璃比色管中，边涡旋边滴加乙腈4.0 mL，再涡旋1 min，2 500 r/min离心3 min，转移上清液至5 mL具塞刻度玻璃管中，用乙腈定容至5.0 mL，涡旋混匀，吸取1.0 mL萃取液于10 mL试管中，加入1 mL 0.1%(体积分数，下同)氨水溶液，混匀，倾入已活化的WCX固相萃取柱中，待样液全部流出后，依次用5 mL水、3 mL甲醇淋洗，弃去流出液，然后用6 mL 2%(体积分数，下同)甲酸甲醇洗脱，接收洗脱液于10 mL试管中，置于40 ℃水浴中氮吹浓缩至干，用1.0 mL乙腈涡旋复溶，以0.22 μm有机滤膜过滤，待UPLC-MS/MS测定。

1.4 UPLC-MS/MS测定条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HILIC色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为0.1%甲酸乙腈+10 mmol/L乙酸铵溶液(95∶5)，等度洗脱；流速0.35 mL/min；柱温30 ℃；进样量2 μL。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI)电离，正离子模式扫描，多反应监测(MRM)模式检测；毛细管电压1.0 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度400 ℃；脱溶剂气流速800 L/h；锥孔气流速50 L/h；碰撞气为氩气，流速0.2 mL/min；化合物的监测离子对(m/z)、锥孔电压等质谱参数见表1。

表1 3种季铵盐的质谱参数

Table 1 MS parameters of three compounds

AnalytePrecursorion(m/z)Daughterion(m/z)Conevoltage(V)Collisionenergy(eV)C12-BAC30491∗，2123025，22C16-BAC36091∗，2683530，25Benzethoniumchloride41291∗，3203535，25

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的选择

根据相似相溶原理，并结合试样的基质特性和待测化合物的性质来选择萃取溶剂。冰淇淋和雪糕的主要成分为乳、糖类、稳定剂、乳化剂、香味剂和着色剂等，水分含量较高，其次为脂肪和蛋白质；而待测季铵盐易溶于水和有机溶剂。鉴于此，为有效提取样品中的待测季铵盐，同时减少脂肪和蛋白质的共提取量，选用乙腈作为提取溶剂。相比于甲醇，乙腈对脂肪的溶解性较小，且沉淀蛋白效果更好。各选取一阴性冰淇淋和雪糕样品，以加标水平为15 μg/kg进行实验，对比了2种基质试样(取样量均为1.0 g)与乙腈用量分别为1.0,2.0,3.0,4.0 mL(即试样与乙腈比值分别为1∶1，1∶2，1∶3和1∶4)时的提取效果，提取液直接用液相色谱-质谱检测；并以2种阴性基质的提取液配制浓度为5 μg/L的基质标准溶液，与相同浓度的纯溶剂标准溶液对应的峰面积相比较，考察基质效应。结果表明：2种基质试样均以1∶3和1∶4提取时分离效果最佳，不存在基质增强或抑制效应；而1∶1和1∶2的提取液均存在基质增强效应，且冰淇淋的基质效应(129%～146%)稍强于雪糕的基质效应(125%～141%)。鉴于3种待测物在质谱检测中有较高的灵敏度，完全满足监测要求，所以实验选择试样与乙腈的最佳用量比为1∶4(m/v)。为防止待测化合物被沉淀的蛋白包裹而影响提取效率，采用边涡旋边添加4.0 mL乙腈的方式进行分散提取；鉴于样品无法全部溶解在提取液中，为保证定量结果的准确性，实验选择将提取液全部转移并用乙腈定容至5.0 mL。

试样与乙腈基本是均相萃取，高速涡旋可使试样与乙腈形成微小液滴，增大互相接触萃取的面积，实现快速有效萃取，故采用涡旋萃取方式，并比较了不同萃取时间(30，60，90，120 s)的萃取效果。实验发现，3种待测物在涡旋萃取30 s后已基本达到平衡，但考虑到不同厂家的产品可能存在一定质构差异，故延长萃取时间至60 s。

2.2 净化条件的优化

在乙腈提取液中可见共提取出的色素，如香芋味雪糕的提取液呈蓝色，菠萝味雪糕的提取液呈黄色等，在后续的净化中应尽量除去色素及其它杂质，以避免污染仪器和干扰检测。

固相萃取(SPE)技术因具有回收率高、稳定性好、操作简单等特点，在分析检测领域被广泛应用。本研究3种待测物是结构上含有芳烃或长链烷烃的季铵盐类化合物，具有强碱性，在溶液中主要以阳离子形式存在，因此比较了亲脂亲水型反相固相萃取柱Oasis HLB(60 mg/3 mL，Waters公司)和混合型弱阳离子交换固相萃取柱Oasis WCX(60 mg/3 mL，Waters公司)的净化效果。以阴性样品提取液配制质量浓度为10 μg/L的混合基质校准溶液进行考察，根据回收率比较萃取净化效果。2种萃取小柱分别按照推荐的方法进行活化。HLB柱根据反相吸附原理，将1.0 mL混合基质校准溶液氮吹至干后，用1 mL水复溶，上柱，以5 mL水淋洗，8 mL甲醇洗脱；WCX柱则根据离子交换原理，在1.0 mL混合基质校准溶液中混入等体积的0.1%氨水溶液，上柱，使萃取体系处于弱碱性环境，令WCX柱填料中的脂肪族羧酸基团保持带负电荷，充分结合阳离子待测物，并用水和甲醇洗去中性、结合力弱的或以阴离子形式存在的化合物，最后以2%甲酸甲醇(6 mL)洗脱。洗脱液均浓缩至干后，以1.0 mL乙腈复溶，UPLC-MS/MS测定，与用乙腈配制的10 μg/L混合标准溶液计算两种净化方法的回收率。结果显示，WCX柱的回收率为90%～100%，优于HLB柱，因此实验选择WCX柱作为固相萃取净化小柱。

图1 3种季铵盐的提取离子色谱图Fig.1 Selective ion chromatograms of 3 analytes

2.3 色谱-质谱条件的优化

3种待测季铵盐在溶液中均以[M-Cl]+存在，易在质谱ESI源的正离子模式下获得较高丰度的母离子[M-Cl]+。分别对确定的母离子进行二级质谱扫描，并根据欧盟2002/657/EC指令，每种待测化合物选择2个主要特征碎片离子作为定性与定量离子，然后对碰撞电压进行优化，使特征碎片离子的强度达到最大。3种待测季铵盐的特征离子对和锥孔电压、碰撞能等质谱条件见表1。

实验对比了BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司)和BEH HILIC色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司)对3种待测物的分离效果。可能由于3种待测季铵盐均有较长的碳链，在C18色谱柱上较难洗脱，且色谱峰形拖尾；HILIC色谱柱是亲水作用的正相色谱柱，有利于分离强极性的化合物，在乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(95∶5)流动相体系中，3种待测季铵盐均获得对称良好的峰形，而在乙腈中添加0.1%甲酸，可提高在ESI+模式下待测物的响应值。所以本实验选用HILIC色谱柱进行色谱分离。在优化条件下，3种待测季铵盐的提取离子色谱图如图1所示。

2.4 线性关系及方法检出限

用乙腈按“1.2”方法配制质量浓度为0.5～20 μg/L的系列混合标准工作溶液，在优化条件下，分别以3种待测季铵盐的定量离子峰面积(y)为纵坐标，相应的浓度(x,μg/L)为横坐标进行回归分析；取一阴性冰淇淋样品按“1.3”进行2个低浓度水平(5.0 μg/kg和10.0 μg/kg)的加标实验，UPLC-MS/MS检测，分别以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)计算3种季铵盐的方法检出限(LODs)和定量下限(LOQs)，结果见表2。3种待测季铵盐在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；方法的LODs为0.9～1.7 μg/kg，LOQs为3.0～5.5 μg/kg，表明方法具有较高的灵敏度，完全满足欧盟的监测要求。

表2 3种季铵盐的线性范围、线性方程、相关系数(r)、LODs和LOQs

Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r),limits of detection and quantitation(LODs and LOQs)of 3 analytes

AnalyteLinearrange(μg/L)RegressionequationrLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)C12-BAC10～20y=55285x+1881099921755C16-BAC05～20y=51365x+1655099950930Benzethoniumchloride05～20y=33306x+131099970930

2.5 回收率与精密度

选取阴性冰淇淋和雪糕样品，按照本方法进行3个浓度水平(1LOQ，2LOQ，10LOQ)的加标回收和精密度实验(n=6)，结果见表3。3种待测物的平均回收率为90.7%～102.2%，相对标准偏差为2.4%～6.4%，表明方法回收率和精密度良好。

表3 回收率及精密度测定结果(n=6)

Table 3 Recoveries and repeatabilities for 3 analytes(n=6)

AnalyteAdded(μg/kg)IcecreamIcemilkRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)C12-BAC55，11，551022，951，93964，47，40907，978，99543，35，32C16-BAC30，60，30945，967，97441，32，26961，983，100547，36，24Benzethoniumchloride30，60，30928，959，98243，39，38933，969，99738，30，29

2.6 实际样品的检测

采用本方法测定了本地市售5个品牌的6个冰淇淋和4个雪糕样品，结果在2个冰淇淋样品中检出C12-BAC，含量分别为18.7 μg/kg和25.3 μg/kg；其余样品均未检出3种待测物。

3 结 论

本文基于固相萃取净化技术，结合UPLC-MS/MS，通过优化实验条件，建立了一种测定冰淇淋和雪糕中3种常用季铵盐类消毒剂的方法。本方法定性定量准确、回收率高、精密度好，能够满足冰淇淋和雪糕中季铵盐类消毒剂的检测需求。

[1] Nunez O,Moyano E,Galceran M T.J.Chromatogr.A,2004,1058:89-95.

[2] Castro R,Moyano E,Galceran M T.J.Chromatogr.A,2001,914:111-121.

[3] Tong H,Qiu S Y.GuizhouChem.Ind.(佟会,邱树毅.贵州化工),2006,31(5):1-7.

[4] Vincent G,Kopferschmitt-Kubler M C,Mirabel P,Pauli G,Millet M.Environ.Monit.Assess,2007,133:25-30.

[5] Mousavi Z E,Butler F,Danaher M.FoodAnal.Methods,2013,6:1265-1270.

[6] de Voorde A V,Lorgeoux C,Gromaire M C,Chebbo G.Environ.Pollut.,2012,164:150-157.

[7] Commission Regulation(EU)No 1119/2014.OfficialJournaloftheEuropeanUnion,2014,L 304/43-L 304/74.

[8] Li Y H,Chen C,Wu J,Hou C Y.Phys.Test.Chem.Anal.：Chem.Anal.(李亚红,陈冲,武杰,侯纯扬.理化检验:化学分册),2010,46(2):136-137.

[9] Nunez O,Moyano E,Galceran M T.J.Chromatogr.A,2002,946:275-282.

[10] Yang Y W,Zhang W Q,Zhu Y.Chin.J.HealthLab.Technol.(杨艳伟,张卫强,朱英.中国卫生检验杂志),2006,16(7):823-824.

[11] Miyauchi T,Mori M,Ito K.J.Chromatogr.A,2005,1095:74-80.

[12] Liu Y Q,Chen Q,Yu H,Tang H H.J.Instrum.Anal.(刘永强,陈倩,于泓,唐慧慧.分析测试学报),2014,33(10):1154-1159.

[13] Tian Q P,Li W Y,Xie K C.Chin.J.Anal.Lab.(田青平,李文英,谢克昌.分析试验室),2009,28(2):21-23.[14] Jin Y,Chen Z F.ChemicalWorld(金燕,陈志峰.化学世界),1999,40(5):266-269.

[15] Ford M J,Tetler L W,White J,Rimmer D.J.Chromatogr.A,2002,952:165-172.

[16] Bassarab P,Willwams D,Dean J R,Ludkin E,Perry J J.J.Chromatogr.A,2011,1218:673-677.

[17] Guo X D,Mu T N,Xian Y P,Luo D H,Wang C.FoodChem.,2016，196:673-681.

[18] Liu C S,Luo H Y,Xian Y P,Wang B,Wang L,Luo D H,Guo X D.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(刘春生,罗海英,冼燕萍,王斌,王莉,罗东辉,郭新东.质谱学报),2014,35(4):302-310.

Determination of Three Quaternary Ammonium Compounds in Ice Creams by Solid Phase Extraction and Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HE Dong*

(Meizhou Teachers’ Academy,Jiaying University,Meizhou 514087,China)

A new method was developed for the determination of three quaternary ammonium compounds(QACs) residues,including dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride(C12-BAC),hexadecyl dimethyl benzyl ammonium chloride(C16-BAC) and benzethonium chloride in ice creams using solid phase extraction(SPE) and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The samples were melted and mixed,and then added into acetonitrile to extract target compounds and precipitate protein.The supernatant was purified with weak cationic exchange solid phase extraction cartridge(WCX) and concentrated in nitrogen stream.The separation of three quaternary ammonium compounds was performed on a Waters BEH HILIC column(50 mm×2.1 mm,1.7 μm) by isocratic elution using acetonitrile(containing 0.1% formic acid)-10 mmol/L ammonium acetate as mobile phase.The targets were analyzed under the multiple reaction monitoring(MRM)mode in positive electrospray ionization.The results showed that the calibration curves of three QACs were linear in the range of 0.5-20 μg/L with correlation coefficients greater than 0.999.The method quantitation limits(LOQs,S/N=10)of three analytes ranged from 3.0 μg/kg to 5.5 μg/kg.The average recoveries were in the range of 90.7%-102.2%,and the relative standard deviation(RSD,n=6) were 2.4%-6.4% at three spiked levels of standard.With the advantages of simplicity,accuracy,sensitivity and good reproducibility,the method could be used for the determination of QACs residues in ice creams.

quaternary ammonium compounds;ice creams;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);solid phase extraction(SPE)

2015-11-23；

2015-12-02

实验技术

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.020

O657.63;S482.2

A

1004-4957(2016)05-0609-05

*通讯作者：何 东，讲师，研究方向：色谱-质谱检测方法，Tel：0753-2523203，E-mail:mzsfhd@163.com