彭治桃,蒋国民,邹 利,李金龙,程小飞,房丽娟,王晓清,刘 丽1,

(1.湖南农业大学 动物科学技术学院，中国 长沙 410128；2.湖南省水产原种场，中国 长沙 410153;3.湖南省水产科学研究所，中国 长沙 410153; 4.中南大学基础医学院，中国 长沙 410012)



锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性比较

彭治桃1,2,蒋国民3,邹 利3,李金龙3,程小飞3,房丽娟4,王晓清1*,刘 丽1,3*

(1.湖南农业大学 动物科学技术学院，中国 长沙 410128；2.湖南省水产原种场，中国 长沙 410153;3.湖南省水产科学研究所，中国 长沙 410153; 4.中南大学基础医学院，中国 长沙 410012)

为研究锦鲫Clock基因表达量分析中的内参基因稳定性，采用qRT-PCR技术进行实时荧光定量分析，并用Ge Norm 和 Norm Finder软件对5个内参基因(RPL13，GAPDH，18SrRNA，β-actin和RPS29)进行稳定性评估，筛选出不同组织中最适合的内参基因，以准确定量Clock基因的相对表达水平.实验结果表明，5个内参基因中，18SrRNA在锦鲫的肌肉、心脏、肝脏中表达最稳定，β-actin在肠中表达最稳定，RPL13在肾中表达最稳定；根据筛选的内参基因定量Clock基因的相对表达水平发现，Clock基因在锦鲫肌肉中相对表达量最高，其次依次是肝脏、肾、肠，心脏中最低.本研究准确定量Clock基因, 为锦鲫生物钟节律机制的下一步研究奠定了理论基础.

内参基因；qRT-PCR；锦鲫；Ge Norm程序；Norm Finder程序

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术因具有灵敏度高、重复性好以及定量准确等优点，被广泛用于生物科学的各个研究领域.但这一技术能否准确定量取决于很多因素，如实验材料质量、RNA质量、cDNA第一链合成效率及内参基因的选择[1].其中，选择合适的内参基因对试验数据进行校正和标准化，获得更接近于目的基因特异性表达的真实值是基因表达定量实验中的关键[2].内参基因，也叫看家(持家)基因，是用来做内部参照的基因, 因具有在各个组织和细胞中表达相对恒定的特点而作为目的基因的相对表达水平时的参照基因.一个理想的内参基因要在不同组织、不同发育阶段以及不同处理因素下都能体现恒定的表达水平.然而，现实中稳定表达的基因几乎不存在，因此选择合适的内参基因用于基因表达差异分析非常关键.Clock基因是一种生物钟基因，在动物的各个组织中广泛表达[3]，在维持正常的近日节律中起着至关重要的作用.本研究选择RPL13，GAPDH，18SrRNA，β-actin和RPS29共 5个候选内参基因，采用 SYBR greenⅠqRT-PCR方法，利用Ge Norm程序和Norm Finder程序研究锦鲫Clock基因表达量分析中这5个内参基因的稳定性.

1 材料与方法

1.1 实验样品

样品采集于湖南省水产科学研究所原种中心，取平均体重为(50±5) g的健康锦鲫中不同组织，包括肌肉、肝脏、心脏、肠、肾共5个.采样前将锦鲫用 MS-222(80 mg/L)麻醉[4]，取样时在放置有冰袋的解剖盘上进行， 样品采集后迅速置于液氮中保存，再转存于-80 ℃冰箱储藏备用.

1.2 总 RNA提取和 c DNA合成

分别取100 mg 冻存组织样品，按照 Trizol试剂法(Invitrogen公司, 美国)提取总 RNA，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳对28 S 和18 S rRNA的完整性进行鉴定，并用紫外分光光度计测定OD260/OD280的值，以检测总RNA的纯度和浓度.按照Prime Script TM reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反转录试剂盒操作流程(TaKaRa公司,日本)，取2 μg总RNA合成cDNA第一链.置于-20 ℃ 备用.

1.3 Clock基因及内参基因的引物设计

选择不同功能的5个常用内参基因，即RPL13(核糖体蛋白基因L13)，GAPDH(3′-磷酸甘油醛脱氢酶)，18SrRNA(18 S核糖体RNA)，β-actin(β-肌动蛋白基因)和RPS29(核糖体蛋白S29基因)进行研究.根据 NCBI 中已公布的锦鲫及与其同源性较高的序列，用 Primer premier 5.0软件设计特异性引物(表1)，并验证引物二聚体、发卡结构等，引物合成和扩增产物的基因序列测定由上海生工公司完成.

表1 Clock基因及内参基因的引物序列

1.4 Clock基因及内参基因qRT-PCR分析

qRT-PCR反应在CFX96TMReal-Time System(BIO-RAD公司,美国)中进行.参照SYBR® Premix Ex Taq II( Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书，准备反应体系为荧光染料SYBR Premix 12.5 μL，cDNA 模板2.0 μL， Forward primer 1.0 μL，Reverse primer 1.0 μL，加无菌水补至总体积25 μL.反应条件为: 95 ℃预变性60 s，95 ℃变性5 s, 65 ℃退火、延伸30 s, 40个循环绘制溶解曲线：65～95 ℃，每0.1 s读板一次.

1.5 数据分析

实时荧光定量PCR结束后，实验数据用Excel软件进行初步处理，采用2ΔCT法进行计算[5],即在Excel 中设定不同样本中某一看家基因CT值最小者的表达量为1，其他样本与此看家基因的相对表达量则为 2-ΔCT，将这些数据导入Ge Norm程序(http:∥medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/)计算内参基因表达稳定度的平均值M(M值越小，表达越稳定)，并通过看家基因标准化因子的配对差异分析(Vn/(n+1))来判定内参基因的最适数目[6].另外，应用 Andersen 编写的程序 Norm Finder算出表明稳定程度的S值(S值越小，表达越稳定)，选出稳定的内参基因与Ge Norm程序分析结果进行综合比较，从而优选出最佳内参基因[6].公式为目的基因的表达量=2-ΔΔCT[7]，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CT内参基因)实验组-(CT目的基因-CT内参基因)对照组.采用SPSS 16.0软件对所得数据进行单因素方差分析(One Way ANOVA)，采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，P<0.05具有显著性差异，所有结果以平均值±标准差(±SE)表示.

2 结果与分析

2.1 引物特异性分析

图1 组织总RNA电泳图Fig.1 The gel electrophoresis of total RNA in different tissues

提取5个组织的总RNA用1.2%的琼脂凝胶电泳进行检测，发现28 S rRNA和18 S rRNA条带清晰，没有弥散现象，说明RNA的完整性良好,没有降解(图1).紫外分光光度计检测OD260/OD280比值为1.9～2.1，说明所提取的组织总RNA符合下一步实验质量要求.对所设计的引物进行普通PCR验证，其扩增片段的特异性和准确性均很好.荧光定量PCR的扩增曲线指数期较明显，扩增曲线整体平行性较好，熔解曲线的熔点峰较窄而尖，无双峰现象，说明产物特异性较好(图2).

2.2 内参基因的表达谱分析

CT值与基因的表达量成反比，即CT值越大,表达量越小,反之亦然.用Sigma Plot 10.0软件对 20个样品 5 种内参基因的表达水平(CT)进行分析(图3)，图中箱代表四分位数，即分别代表第25 百分位数和第75百分位数，箱中间的线代表中位数，上下线分别代表最大值和最小值.结果显示7个看家基因的CT值在17～33之间,其中18SrRNA，RPL13和β-actin的CT值较低，RPS29和GAPDH的CT值较高,说明各内参基因在锦鲫中的表达量不同，而且差别比较大.

图2 荧光定量PCR图(A:扩增曲线;B:溶解曲线)Fig.2 Amplification curve (A) and Melting curve (B) of qRT-PCR

图3 qRT-PCR中内参基因的CT值分布Fig.3 The CT value distribution of five reference genes in qRT-PCR

2.3 内参基因的稳定性比较

图4显示，通过Ge Norm 软件分析得出M值来评价内参基因的表达稳定性，不同组织中内参基因的稳定性不同.M值从大到小(基因稳定性从最不稳定到最稳定)依次为：肌肉中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13和18SrRNA；心脏中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13和18SrRNA；肝脏中，RPS29，GAPDH，β-actin，18SrRNA和RPL13；肠中，18SrRNA，RPS29，GAPDH，β-actin和RPL13；肾中，RPS29，18SrRNA，β-actin，RPL13和GAPDH，说明肌肉、心脏和肝脏的2个最适合内参基因均为RPL13和18SrRNA，而肠为β-actin和RPL13，肾为RPL13和GAPDH.通过Ge Norm标准化因子配对分析，发现本实验5个内参基因在5个组织中，Vn/(n+1)均小于1.5，说明有n个基因可以作为qRT-PCR 定量分析的内参基因，无需再选择使用≥n+1个基因作为内参.

图4 肌肉(A)，心脏(B)，肝脏(C)，肠(D)，肾(E)中内参基因的稳定性比较(Ge Norm 分析和 Norm Finder分析)Fig.4 Expression stability of reference genes in different tissues by Ge Norm and Norm Finder(A, Muscle; B, Heart; C, Liver; D,Intestine; E,Kidney)

通过Norm Finder 软件分析得出，S值从大到小(基因稳定性从最不稳定到最稳定)依次为：肌肉中，β-actin，GAPDH，RPS29，RPL13，18SrRNA；心脏中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13，18SrRNA；肝脏中，GAPDH，β-actin，RPS29，RPL13，18SrRNA；肠中，RPS29，18SrRNA，GAPDH，RPL13，β-actin；肾中，RPS29，18SrRNA，β-actin，GAPDH，RPL13. Ge Norm软件分析的结果得出最适合的内参基因数，而Norm Finder 软件分析能选出稳定性最高的内参基因.因此，综合比较 2 种软件的评价结果，筛选出肌肉、心脏、肝脏中最佳内参基因均为18SrRNA，而肠中最佳内参基因为β-actin，肾中的为RPL13.

2.4 Clock基因的表达水平

图5 锦鲫Clock基因相对表达水平 Fig.5 Relative expression levels of Clock genes in Carassius auratus

根据锦鲫内参基因的稳定性评价结果，肌肉、心脏、肝脏以18SrRNA作为内参基因，肠以β-actin和肾以RPL13作为内参基因，采用qRT-PCR方法进行定量，检测锦鲫不同组织中Clock基因表达量.图5结果表明，Clock基因在肌肉中相对表达量最高，其次依次是肝脏、肾、肠，心脏中最低(P<0.05).

3 讨论

到目前为止，还没有发现一种不受外界因素影响、能够在所有组织细胞中都能稳定表达的理想内参基因[8].实验时如果盲目选择某单一内参基因，势必会影响到定量目的基因表达水平的检测精度.目前国外文献中都要求用qRT-PCR技术首先对内参基因进行筛选和优化，选择最合适的看家基因作为内参.我国也有关于内参基因的筛选和优化的相关文献[9]，但90%以上的文献还是以单个内参基因进行定量，并未对所选内参基因进行稳定性分析.

本研究采用Norm Finder和Ge Norm两个软件，对5个候选内参基因β-actin，GAPDH，RPS29，RPL13和18SrRNA在锦鲫的5个组织中的表达稳定性进行了分析.结果表明，5个内参基因在锦鲫的肌肉、心脏、肝脏、肠和肾中表达稳定性不同，18SrRNA在肌肉、心脏、肝脏中的表达最稳定，β-actin在肠中的表达最稳定，RPL13在肾中的表达最稳定.有文献报道，18SrRNA在丝光绿蝇的不同发育时期和长虹猎蝽的不同组织中的表达均较为稳定，而在褐飞風和桔小实蝶的不同组织中表达极不稳定[10].蒋晓梅等[11]研究表明，在盐胁迫和热胁迫条件下，18SrRNA基因表达稳定性最高.鲍相渤等[12]对饥饿胁迫下6个候选内参基因在虾夷扇贝的各个组织中的稳定性表达进行研究，发现β-actin在鳃、肾、血淋巴中稳定性最好，GAPDH受饥饿胁迫后各组织中的表达稳定性较差，但受急性感染和升温试验时表现出较好的表达稳定性.而周瑞雪等[13]以β-actin、18SrRNA和GAPDH3种内参基因定量草鱼早期发育时期肌球蛋白重链基因的mRNA表达量时优选出β-actin和GAPDH作为看家基因.Nishimura等[14]通过Ge Norm 分析筛选出老鼠肝脏老化研究中合适的内参基因为HPRT1和GAPDH. Schmidt 等[15]研究证明，GAPDH在烟草中表达不稳定.刘金泊等[16]优选出RPS18和RPL13作为内参基因，分析赤拟谷盗受磷化氢诱导后的表达.李迪等[17]通过Ge Norm软件分析发现，在鳜鱼不同组织中B2M和RPL13为最佳内参基因.综上所述，必须根据不同的试验对象和试验目的选用多种内参基因比较qRT-PCR 数据，以获得相关目的基因的准确定量，特别是那些仅有细微表达差异的研究.

Clock基因是第一个被发现的脊椎动物生物钟基因[18]，具有高度保守性，在动物组织中广泛表达，如Clock基因的 mRNA在小鼠视交叉上核、脑、心、肝、肺、肾、睾丸和卵巢均有表达[19].山羊中Clock基因的mRNA发育性表达模式具有组织特异性[20].塞内加尔鳎中Clock基因广泛表达于视网膜、视顶盖、间脑、小脑和肝脏[22]，虹鳟中Clock1a在视网膜和下丘脑中表达较高[22]，瓦氏黄颡鱼中Clock基因在大脑，肝脏和小肠有表达[23].可见，Clock基因在不同物种和不同组织中表达有差异，本研究也有类似发现，Clock基因在锦鲫5个组织中相对表达量有差异，且在肌肉和肝脏中表达较高.

综上所述，本研究运用Norm Finder和Ge Norm两个软件，成功筛选出了锦鲫5个不同组织中表达最稳定的内参基因，提高了锦鲫Clock基因表达量分析的准确性.Clock基因表达差异性表明，其在不同组织中的生物节律调控功能不同，这为进一步探明锦鲫生物钟的调控机制奠定了一定的理论基础.

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(编辑 WJ)

Stability Comparison of Reference Genes on Expression Analysis ofClockGene inCarassiusAuratus

PENGZhi-tao1,2,JIANGGuo-min3,ZOULi3,LIJin-long3,CHENGXiao-fei3,FANGLi-juan4,WANGXiao-qing1*,LIULi1,3*

(1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China;2. Aquatic Products Seed Stock Station in Hunan Province, Changsha 410153, China;3. Fisheries Research Institute of Hunan Province, Changsha 410153, China;4. College of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410012, China)

The aim of this study is to compare the stability difference of reference genes from the expression analysis ofClockgene inCarassiusauratus. The mRNA expression of five candidate reference genes such asRPL13,GAPDH18SrRNA,β-actin, andRPS29 were detected by using the qRT-PCR method, and Ge Norm and Norm Finder software packages. The optimal reference genes selected by analyzing and evaluating their mRNA expression stability were applied to accurately quantify the relative expression level of theClockgene in different tissues ofCarassiusauratus. Our results show that one of the most stable reference genes was 18SrRNAfrom three tissues, including muscle, heart, and liver, among the five reference genes, whereas that found in intestines wasβ-actinand in kidney wasRPL13. When these optimal reference genes were selected in five tissues, we found that the relative expression level of theClockgene was the highest in the muscle tissue, followed by liver, kidney, and intestines, and the lowest was in heart. In summary, this study has accurately quantified the relative expression levels of theClockgene in tissues, which should serve as the theoretical basis for the future investigation of theClockgene rhythm system.

reference gene; qRT-PCR;Carassiusauratus; Ge Norm software; Norm Finder software

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.06.007

2016-06-21

国家自然科学基金资助项目(31372530)

S917.4

A

1000-2537(2016)06-0037-06

*通讯作者,E-mail：wangxiao8258@163.com；hnhhliliu@163.com