范彩霞 范世平 陈志喜 赖淑贞 郑锦坤 赖新华

鼻咽清颗粒对鼻咽癌CNE-2细胞周期和凋亡的影响及可能机制*

范彩霞1范世平1陈志喜1赖淑贞1郑锦坤1赖新华1

目的 探讨鼻咽清颗粒对鼻咽癌CNE-2细胞周期、凋亡影响及其可能作用机制。方法 CNE-2细胞Hoechst 33342-PI双染后，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测（flow cytometry FCM)检测细胞周期和凋亡考察鼻咽清颗粒对CNE-2细胞周期和细胞凋亡的影响，West-blot考察鼻咽清颗粒对CNE-2细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响。结果 与阴性对照组相比，随着鼻咽清颗粒浓缩液浓度增加，细胞凋亡率增加，G1的比例增加，West-blot实验结果表明，随着培养基中鼻咽清主药浓度的增加，促进细胞凋亡的Caspase-3蛋白表达增加，抑制细胞凋亡Bcl-2蛋白表达降低。结论 鼻咽清颗粒能诱导caspase-3表达，下调Bcl-2蛋白表达，将CNE-2细胞阻滞于G1期，诱导细胞凋亡。

鼻咽清颗粒；鼻咽癌细胞；细胞凋亡；细胞周期

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)为我国一种常见的恶性肿瘤，俗称广东瘤(Canton Cancer)，年发病率为10～25/l0万人，占全身恶性肿瘤的2.81%，居第8位[1，2]。目前鼻咽癌临床治疗手段主要有放疗或以放疗为主、化疗、生物治疗为辅的综合治疗。化疗在鼻咽癌的治疗中发挥重要作用，但是由于化疗导致的骨髓抑制，恶心、呕吐、食欲下降等消化道不良反应以及肝、肾功能损害，严重影响患者生活质量。而中成药或中药提取物在肿瘤治疗方面通过增强肿瘤细胞对放疗与化疗的敏感性、减轻放疗与化疗的毒副作用、直接杀伤癌细胞、抑制癌症组织的发展，防止癌症转移与复发，提高无病生存率与改善患者生活质量方面发挥重要作用[3-5]。鼻咽清颗粒主要由重楼、夏枯草、两面针、蛇泡勒、野菊花、苍耳子、龙胆草、太子参八味中药组成，现代药理学研究证实，组方中重楼、夏枯草、两面针、蛇泡勒、野菊花、龙胆草等都具有抗肿瘤活性[6-11]，具有清热解毒，消炎散结功效的鼻咽清冲剂，在临床上主要用于鼻咽肿痛，鼻咽慢性炎症，鼻咽癌放射治疗后分泌物增多等，可能有协同抗癌和放疗增敏等潜能，相关研究尚不够深入。

本研究以鼻咽癌细胞CNE-2细胞株为模型，体外考察鼻咽清颗粒对CNE-2细胞周期及凋亡的影响并对其可能机制进行研究。从而为鼻咽清颗粒对NPC辅助治疗的临床应用奠定基础。

材料与方法

1 材料

1.1 实验仪器

HH-8恒温水浴锅 (金坛市晶玻实验仪器厂)，Bio-II-A/M生物安全柜（西班牙TELSTAR），奥林巴斯IX73倒置显微镜、Thermo Scientific Series 8000直热式CO2培养箱（赛默飞世科技有限公司），Elx酶标仪（Bio-TEK-INSTUMENTS INC)，TE2000-E荧光倒置显微镜（Nikon），EPICS XL流式细胞仪(美国COULTER公司)，台式低温超速离心机(3K18,德国Sigma)、琼脂糖水平电泳槽和电泳仪 (E-C APPARATUERS)、凝胶成像仪(Eppendorf)、超声细胞粉碎仪（JY92-IIN浙江宁波新芝）；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（Mini PROTEAN 3 Cell，美国Bio-Rad)；真空转印仪（bio-rad785型美国）；小型台式离心机(Sigma 1-15)；Chemi Imager 5500 V2.03扫描系统、Fluor Chen 2.0和JS-6800凝胶图像分析（上海继锦化学有限公司）。

1.2 试剂

胰蛋白酶（GIBCO）、甲基噻唑蓝 (MTT)(美国Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，DMEM高糖培养基（GIBCO），Annexin V-FITC/ PI双染检测细胞凋亡试剂盒 (贝博生物技术有限公司)，细胞周期与细胞凋亡试剂盒 (碧云天)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，注射用顺铂（齐鲁制药，批号：20140724）。Trisbase(上海生工公司)，TRIZOL总RNA提取试剂 (Invitrogen公司)，DL-2000 DNA Marker(宝生物公司)，溴化乙锭(EB)（北京新经科公司），焦碳酸二乙酯(DEPC)(北京新经科公司)，小鼠抗Bcl-2和Caspase3(Santa Cruz公司)，山羊抗小鼠、兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(北京中山生物技术公司)，增强化学发光法试剂盒(美国Santa Cruz公司)。

1.3 细胞株

人鼻咽癌细胞CNE-2由南方医科大学肿瘤中心实验室传代培养赠送。

1.4 实验药材

重楼、夏枯草、两面针、蛇泡勒、野菊花、苍耳子、龙胆草、太子参八味中药均购自广东省国药控股韶关分公司，由两位经验丰富的副主任中药师鉴定验收。

2 方法

2.1 鼻咽清方浓缩液的制备

按照鼻咽清颗粒处方组成比例，根据本院医院制剂生产规范，取地道药材，置提取罐中,加水回流提取2次，每次沸后两小时,过滤弃渣,合并提取液,药液浓缩至相对密度为1.20～1.30(80℃)的稠膏，浓缩体积相当于干药材的质量（1ml浓缩液相当于1g干药材质量），充分搅拌、灌装、灭菌，配制鼻咽清方浓缩液，4℃保存备用。

2.2 细胞培养

CNE-2细胞培养于含10%小牛血清，100U/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液中，37℃、5%CO2，细胞培养箱培养，2天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。

2.3 荧光倒置显微镜观察细胞形态考察鼻咽清方浓缩液加入量对CNE-2细胞凋亡的影响

取对数生长期的CNE-2细胞，调整细胞浓度为2.0×105个/ml，接种于24孔板中，每孔接种500 μL。在37℃、5%CO2条件下培养过夜后，吸出培养液，加入新鲜培养液和不同体积的鼻咽清颗粒浓缩液，使其终浓度为相当于生药量10、20、30、40、50mg/ml，同时设置阴性对照，阴性对照组只加培养基不加药物，继续培养24h后，加入50μm浓度为100μg/ml Hoechst 33342 37℃染色15min，用预冷的PBS洗涤2次，再加入浓度为50μg/ml的PI染色液于冰上染色15min，PBS洗涤2次，于荧光倒置显微镜在蓝色光源下观察并拍照。

2.4 Annexin-V-FITC/PI双染分析鼻咽清颗粒浓缩液对CNE-2细胞凋亡的影响

细胞培养、取生药量为0、10、20、30mg/ml组和阳性对照组（阳性对照组选用5μg·ml-1顺铂溶液，分别在给药24h后，用不含EDTA的胰酶消化，1000r/min离心5分钟，弃上清，收集细胞，每组3个样本。按照试剂盒的说明方法处理染色细胞：PBS洗涤1次后，用1ml PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于105），然后1000g离心5分钟，收集细胞，加入400μl 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞。加入5μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。加入10μl PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5分钟。2次，加入5μl FITC Annexin-V避光染色5min，和5μl PI，轻微振荡，室温下（25°C）避光孵育15min流式细胞仪检测。

2.5 流式细胞仪分析鼻咽清颗粒对CNE-2人鼻咽癌细胞周期的影响

取对数生长期的人鼻咽癌细胞CNE-2，PBS洗2遍后，0.25%胰蛋白酶液消化，用含10%胎牛血清的培养基制备DMEM全培配成浓度为2.0×105个/ml的细胞悬液，接种于7.5cm2的培养瓶中，每瓶接种5ml。在37℃、5%CO2条件下培养过夜后，吸出培养液，加入新鲜培养液及鼻咽清颗粒浓缩液，使其终浓相当于生药量为10mg/ml，20mg/ml和30mg/ ml,同时设置阴性对照和阳性对照组，阴性对照加相同体积的培养液，阳性对照组加入适量顺铂注射液并用培养基稀释，使顺铂浓度为5μg/ml。分别在给药后24h，0.25%胰酶+EDTA消化，离心收集，PBS洗2次，细胞沉淀用70%乙醇悬浮，在-20℃冰箱固定24h以上。PBS离心洗去乙醇后，取碧云天公司细胞周期和凋亡试剂盒，并按照试剂盒说明染色30分钟，400目筛网过滤，用流式细胞仪检测DNA含量，分析细胞周期并测定凋亡率（激发波长488nm，发射波长630nm）。

2.6 Western blot法检测检测Bac-2和caspase-3的表达

按2.5方法培养鼻咽癌CNE-2细胞、分组。加入鼻咽清方浓缩液及含有顺铂溶液后（阳性对照），培养24h后，4℃预冷的PBS洗2次，按照west-blot总蛋白提取方法提取蛋白、测定蛋白含量，按照Western Blot说明书提示检测Bcl-2、Caspase3蛋白的表达。使用Chemi Imager 5500 V3.0软件进行图像灰度扫描，Fluor Chen 2.0分析软件进行分析，获取目的条带的整合光密度值(IDV)作为表达强度，以β-actin作为蛋白表达的相对强度进行比较。

3 统计学的处理

数据用x¯±s表示，应用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较用LSD法，P<0.05为差异有统计性意义。

结果

1 荧光倒置显微镜观察不同浓度鼻咽清方对CNE-2细胞凋亡的影响

经Hoechst-PI双染的CNE-2细胞，阴性对照组细胞大小均一，呈圆形或椭圆形，细胞着色少，大部分呈低蓝色，只有极少量的呈高蓝色。随着培养基中鼻咽清方浓缩液浓度的增加，紫外灯激发下，呈亮蓝色比例增加，细胞内出现致密浓染颗粒状荧光当鼻咽清方浓缩液浓度为40mg、50mg/ml，大部分细胞呈亮蓝色，出现大量凋亡小体，见图1。

图1 不同浓度鼻咽清颗粒浓缩液与CNE-2细胞孵化24h后、Hoechst 33342-PI双染的荧光倒置显微镜图

2 流式细胞仪分析鼻咽清颗粒对人鼻咽癌细胞CNE-2细胞凋亡的影响

FCM分析显示0、10、20、30mg(以生药量计算)/ ml鼻咽清颗粒浓缩液作用24h后,随着生药量浓度增加，凋亡细胞的比例逐步增加，存在良好的线性关系，有很好的相关性，满足凋亡率Y=0.811x(浓度) +1.56，R2=0.9996。见图2。

图2 鼻咽清方浓缩液的浓度对细胞凋亡的影响

3 流式细胞仪分析鼻咽清颗粒对人鼻咽癌细胞CNE-2细胞凋亡的影响

FCM分析细胞周期实验表明，0、10、20、30mg/ ml鼻咽清方浓缩液和含有顺铂注射液的培养基与鼻咽癌CNE-2细胞孵化24h后，G1期细胞比例分别为（42.62±5.05%，47.91±6.97%,55.34±6.46%和68.71±7.89和76.68±6.46%），差异显著（P<0.05），说明鼻咽清方浓缩液可将CNE-2细胞阻滞于G1期，随着鼻咽清方浓缩液浓度的增加，阻滞作用越明显。

4 鼻咽清颗粒对CNE-2细胞Bcl-2、caspase-3蛋白表达影响

不同剂量的鼻咽清方浓缩液与CNE-2细胞作用24h后，Western Blot法检测Bcl-2和Caspase3蛋白的表达。如图3所示，鼻咽清方浓缩液以剂量依赖方式抑制Bcl-2蛋白表达，增加Caspase3蛋白表达，与空白对照组，10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml和20μg/ml顺铂组分别显著降低Bcl-2蛋白表达水平（P<0.01）,并促进caspase-3蛋白的表达（P<0.01)。

图3 鼻咽清方浓缩液对CNE-2细胞Bcl-2和Caspase3蛋白表达的影响（n=8）

讨论

肿瘤的发生、发展与很多因素相关，而细胞凋亡的减少是其中一个关键因素。临床实践表明，单独应用中药或中西医结合治疗某些肿瘤疗效确切，诱导肿瘤细胞发生凋亡就是它们治疗恶性肿瘤的主要途径之一[13]。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，从受基因编程调控的意义上讲，细胞凋亡又称程序性细胞死亡（Programmed cell death）而细胞凋亡发生的信号转导途径是多样的，这些途径之间相互促进或制约，形成了错综复杂的调控网络。其中P53蛋白、Caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白等在凋亡的信号转导中起着重要作用[14，15]。

本研究通过Hoechst 33342-PI双染的结果表明，不同浓度的鼻咽癌浓缩液与人鼻咽癌CNE-2细胞孵化24h后，细胞形态出现不同程度的皱缩，变形，胞浆浓缩、核染色质聚集及核固缩现象，出现凋亡小体。尤其是高浓度组，出现大量凋亡小体。FCM细胞凋亡检测表明，随着鼻咽清方浓缩液生药浓度的增加，凋亡细胞的比例逐步增加，有良好的线性及正相关性，提示鼻咽清方浓缩液对人鼻咽癌CNE-2细胞的生长抑制，促进细胞凋亡，west-blot结果提示随着鼻咽清方浓缩液浓度的增加，抑制细胞凋亡的蛋白Bcl-2表达下降，促进细胞凋亡的蛋白caspase-3表达增加，各组差异显著，可能鼻咽清方浓缩液相关有效成分作用于靶细胞与CNE-2细胞表面受体结合后，下调抗细胞凋亡Bcl-2蛋白和上调促细胞凋亡caspase-3蛋白的表达,从而细胞凋亡凋亡有关，采用流式细胞仪检测不同浓度的鼻咽清方浓缩液作用于CNE-2细胞24h，结果表明细胞被阻滞在G1期。

通过本研究表明鼻咽清颗粒可以通过抑制抗凋亡细胞蛋白如Bcl-2及促凋亡蛋白如Caspase-3的表达，将鼻咽癌细胞CNE-2细胞阻滞于G1期，促进细胞凋亡。

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（收稿:2016-04-06 修回：2016-06-06）

Bi-Yan-Qing Granula influence nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2 on cell cycle distribution and cell apoptosis

FAN Caixia,CHEN Zhixi,FAN Shiping,LAI Shuzhen,ZHENG Jinkun,Lai Xinhua
Affiliated YueBei People’s Hospital of Medical College of Shantou University,Guangdong,Shaoguan,512026

Objective To investigate the influence and p-otential machnism of Bi-Yan-Qing Granula on cell cycle distribution and apoptosis of nasopharyngeal cancinoma cell CNE-2.Methods CNE-2 cell apoptosis was observed by Hoechst-PI double staining;while cell cycle distribution and apoptosis was evaluated by flow cytometry(FCM),West-blot was uesed to determine the experess of Caspase-3 and Bcl-2.Results With the increase of the concentration of Bi-Yan-Qing solution,apopotosis and G1 phase increase compared with control group(P<0.05),West Blot showed after treatment with Bi-Yan-Qing Granula concentrated solution caspase-3 protein expression increased,while Bcl-2 protein expression decresed.Conclusions Bi-Yan-Qing Granula can promote apoptosis and G1 Cell cycle arrest of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2 by inducing expression of caspase-3 protein as well as inhibiting Bcl-2 protein expression.

Bi-Yan Qing Granula;nasopharyngeal carcinoma cell line;cell apoptosis;cell cycle

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.003

广东省中医药局项目（20122043）韶关市医药卫生科研计划项目Y12159

广东省重大新药创制重大科技专项资金项目2013A022100011

1汕头大学医学院附属粤北人民医院（广东韶关，512026）

范彩霞,副主任药师.Email:mydream0509@qq.com