郭敬强 林胜璋

人参皂甙Rg3对胰腺癌SW-1990细胞皮下移植瘤血管生成拟态影响的研究

郭敬强 林胜璋

目的 研究人参皂甙Rg3对胰腺癌SW-1990细胞皮下移植瘤生长及血管生成拟态的影响。方法 用胰腺癌SW-1900细胞株建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，分成4组：0.9%氯化钠溶液对照组、5mg/kg人参皂甙Rg3组、10mg/kg人参皂甙Rg3组、20mg/kg人参皂甙Rg3组，每组7只。各组裸鼠予腹腔注射给药，隔天1次，给药4周。给药结束后3d处死裸鼠，检测各组移植瘤的体积和重量；CD31/PAS染色观察移植瘤血管生成拟态的变化；荧光定量PCR和Western b lot检测各组移植瘤钙粘蛋白（VE-Cadherin）、络氨酸激酶受体2（EphA2）、基质金属蛋白2（MMP-2）、基质金属蛋白9（MMP-9）m RNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较，20mg/kg人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤体积减小、重量减轻（均P＜0.05）。与对照组比较，5mg/kg人参皂甙Rg3组、10mg/kg人参皂甙Rg3组、20mg/kg人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤拟态、正常血管生成均减少（均P＜0.05），VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9 m RNA和蛋白表达水平均降低（均P＜0.05）。结论 人参皂甙Rg3可抑制胰腺癌SW-1900细胞皮下移植瘤生长和血管生成拟态形成，可能是通过调控VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9的表达发挥抗肿瘤作用。

裸鼠皮下移植瘤 血管生成拟态 钙粘蛋白 络氨酸激酶受体2 基质金属蛋白9 基质金属蛋白2

胰腺癌是病死率极高的恶性肿瘤，患者5年生存率仅为6%[1]。恶性肿瘤的生长、侵袭、复发和转移离不开血液供应[2]。研究发现，部分高度恶性、侵袭性的肿瘤细胞自身可通过内皮化相互连接，形成特殊的微循环管道向肿瘤提供血供，这种不依赖于内皮细胞的肿瘤内血管生成模式称为血管生成拟态[3]。人参皂甙Rg3是从人参中提取的一种微量四环三萜皂甙，能够抑制肿瘤新生血管形成[4]。笔者前期研究发现，胰腺癌SW-1990细胞在体外鼠尾I型胶原蛋白建立的三维培养环境中能形成血管生成拟态[5]。基于此，本研究通过观察人参皂甙Rg3对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型的干扰效果，分析其对胰腺癌细胞的生长及血管生成拟态的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂和动物 人参皂甙Rg3（纯度≥98%）购自上海博蕴生物科技有限公司。MMP-2抗体购自美国Abgent公司，MMP-9抗体购自美国Abcam公司，VE-cadherin抗体购自美国abgent公司，EphA2抗体购自美国R&D公司。BALB/C-nu裸鼠（雄性，4~6周龄，体重18~22g）购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2 细胞培养 胰腺癌SW-1990细胞株购自美国ATCC公司。胰腺癌SW-1990细胞复苏后放入高糖DMEM培养液（含10%灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/L链霉素），置于37℃、饱和湿度、含5%二氧化碳及95%空气的孵箱中无菌培养；待细胞生长至70%~ 80%时，用胰酶消化后传代。

1.3 胰腺癌皮下移植瘤模型建立、分组 裸鼠在SPF级饲养环境中稳定1周；将2×106/100μl的胰腺癌SW-1990细胞悬浮液在无菌条件下接种于裸鼠背侧近右后肢处皮下，每只裸鼠接种100μl，接种3d后胰腺癌皮下移植瘤模型建立成功；将裸鼠随机分成4组，每组7只，分别给予0.9%氯化钠溶液（对照组）、5mg/kg人参皂甙Rg3、10mg/kg人参皂甙Rg3、20mg/kg人参皂甙Rg3，隔日腹腔注射给药1次，共给药4周，每次给药前称量裸鼠体重。给药结束后3d处死裸鼠，切除移植瘤标本并拍照记录；每组移植瘤组织部分多聚甲醛固定，备作切片用，余组织冻存液氮中，留作其他指标检测用。

1.4 胰腺癌皮下移植瘤血管生成拟态检测 各组移植瘤组织经多聚甲醛固定后，作3μm连续切片，将石蜡切片脱蜡至水,高压煮沸抗原修复10min；3%的过氧化氢灭活过氧化物酶20min，滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，滴加50μl一抗CD31，4℃过夜；37℃水浴箱复温45min，滴加山羊抗鼠生物素标记的二抗，37℃孵育60min；DAB复染8min，流水冲洗，自来水、蒸馏水各洗3遍，高碘酸作用10min，流水冲洗1min，自来水冲洗1次；然后置于Schiff液中，目测组织出现紫红质后流水冲洗终止；苏木素复染2min，流水冲洗12min。血管生成拟态判定方法[6]：高倍显微镜下（× 400）随机选取10个视野观察计数拟态血管，各组取平均值；肿瘤组织中出现CD31阳性、PAS染色阴性的为血管内皮依赖的正常血管，CD31阴性、PAS染色阳性且管腔内发现红细胞的为拟态血管。CD31阳性表现为正常血管内皮结构部分染成棕黄色，PAS染色阳性表现为拟态血管管壁及壁及细胞外基质染成紫红色。

1.5 钙粘蛋白（VE-Cadherin）、络氨酸激酶受体2（EphA2）、基质金属蛋白2（MMP-2）、基质金属蛋白9（MMP-9）mRNA表达水平检测 采用荧光定量PCR。用Trizol一步法提取各组移植瘤组织中总RNA，RNA上样量5μg，按逆转录试剂盒说明书作cDNA合成，cDNA用DEPC水稀释3倍；VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9和内参GAPDH的引物用1X TBE Buffer稀释成10pmol/ml待用；扩增好的cDNA、待用的稀释引物、荧光PCR水、SYRB Green按照SYRB Green 5μl、上下游引物各1μl、cDNA 1μl、余下用荧光PCR水补足配成10μl的反应体系，应用荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）扩增45个循环；结果用Light Cycler480软件分析。各引物序列和产物长度见表1。

表1 各引物序列和产物长度

1.6 VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平检测 采用Western blot法。提取各组移植瘤组织蛋白，蛋白上样量60μg；配好体系的蛋白分次SDS-PAGE电泳，先恒压70V电泳，待标记Maker分开后调电压至120V直至指示蓝泳到胶板下方，恒流300mA转膜；1×TBS平衡5min，5%的脱脂牛奶封闭2h，加入一抗（MMP-2 1∶100，MMP-9 1∶1 000）4℃过夜，加入二抗（1∶5 000）室温下放置2h，1×TBS洗涤后，加ECL化学发光曝光，结果用Alpha Ease FC 4.0软件分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以 表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 4组裸鼠生存情况比较 给药结束时，对照组裸鼠死亡1只，排除了由于实验操作不当致死的可能，其死亡是由肿瘤本身恶化或药物毒副反应所致；对照组其余裸鼠瘤块增长显著，精神状态尚可，饮食和大小便正常。人参皂甙Rg3组小鼠精神状态、活动状况、体重下降幅度、食欲和尿、便等未见明显异常。

2.2 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生长情况比较 见图1、表2。

图1 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生长情况比较

表2 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生长情况比较

由图1、表2可见，4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤体积、重量比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与对照组比较，5mg/kg人参皂甙Rg3组、10mg/kg人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤体积均缩小（均P＜0.05）；移植瘤重量均减轻，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。20mg/kg人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤与5mg/kg人参皂甙Rg3组、10mg/kg人参皂甙Rg3组、对照组比较，体积均缩小、重量均减轻（均P＜0.05）。

2.3 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成情况比较 见图2、表3。

图2 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成情况比较（a：对照组；b：5m g/k g人参皂甙 R g3组；c：10m g/k g人参皂甙 R g3组；d：20m g/k g人参皂甙R g3组；CD31/PAS染色，×400）

表3 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成情况比较（支）

由表3可见，4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤拟态、正常血管生成情况比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与对照组比较，5mg/kg人参皂甙Rg3组、10mg/kg人参皂甙Rg3组、20mg/kg人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤拟态、正常血管生成均减少（均P＜0.05），且10mg/ kg人参皂甙Rg3组、20mg/kg人参皂甙Rg3组均少于5mg/kg人参皂甙Rg3组（均P＜0.05），但20mg/kg人参皂甙Rg3组与10mg/kg人参皂甙Rg3组比较均无统计学差异（均P＞0.05）。

2.3 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平比较 见表4。

表4 4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VE-Ca d h er in、Ep hA2、MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达水平比较

由表4可见，4组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VECadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05）。5mg/kg人参皂甙Rg3组、10mg/kg人参皂甙Rg3组、20mg/kg人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤VE-Cadherin、EphA2、 MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达水平均低于对照组（均P＜0.05），且20mg/kg人参皂甙Rg3组亦均低于5mg/kg人参皂甙Rg3组、10mg/kg人参皂甙Rg3组（均P＜0.05），但5mg/kg人参皂甙Rg3组和10mg/kg人参皂甙Rg3组比较均无统计学差异（均P＞0.05）。

3 讨论

人参发挥抗肿瘤作用的活性成分是人参皂甙，其中人参皂甙Rg3具有抑制新生血管形成的作用[7]。血管生成拟态是指高度恶性、功能上具有可塑性的肿瘤细胞形成的血管网络，其与肿瘤的生长、进展、转移及预后密切相关[8-9]。本研究结果显示，与对照组比较，人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的体积均减小、重量均减轻，当人参皂甙Rg3达到一定给药浓度时存在统计学差异；同时发现，人参皂甙Rg3组裸鼠胰腺癌皮下移植瘤拟态、正常血管生成均较对照组减少，这提示人参皂甙Rg3可抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成拟态形成，改善荷瘤裸鼠生存质量。

研究发现利用VE-cadherin阻滞剂或硫代硫酸根修饰寡核苷酸的方式阻止VE-cadherin的表达，可抑制高度恶性黑色素瘤细胞形成血管拟生态[10]。Angela等[11]发现免疫荧光显示高度恶性黑色素瘤细胞在体外形成的管样网络通道中可见酪氨酸激酶磷酸化、EphA2高表达，利用酪氨酸及酶抑制剂或敲出EphA2均能抑制血管生成拟态的形成。同时VE-cadherin使EphA2局限于细胞膜上，与相邻细胞膜上配体结合而磷酸化，调控EphA2表达，进一步影响血管生成拟态的形成。同时磷酸化的EphA2能够激活FAK和PI3K，再分别引起laminin5r分解成片段和激活MMP-2影响血管生成拟态的形成[12-13]。另有研究发现，转染了细胞外基质金属蛋白酶（CD147）cDNA的低侵袭性卵巢癌细胞在三维培养中可形成血管样结构，其MMP-2、MMP-9的活性均增强、表达水平均增加，促进血管生成拟态的形成[14]。本研究结果显示，人参皂甙Rg3作用于胰腺癌SW-1990细胞建立的裸鼠皮下移植瘤后，VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达水平均下降。这说明人参皂甙 Rg3或是通过调控胰腺癌细胞 VECadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9的表达水平，发挥其抗肿瘤作用。

综上所述，人参皂甙Rg3可抑制裸鼠胰腺癌SW-1990细胞株移植瘤的生长，抑制胰腺癌血管生成拟态。这可能与人参皂甙Rg3抑制胰腺癌细胞VE-Cadherin、EphA2、MMP-2、MMP-9的表达水平有关，而更详细的分子机制有待进一步深入研究。

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Effect of ginsenoside Rg3 on grow th and vasculogenic mimicry of implanted human pancreatic cancer in nude mice

GUO Jingqiang，LIN Shengzhang.Department of Hepatobiliary Surgery，Lishui Central Hospital，Lishui 323000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of ginsenoside Rg3 on g row th and vasculogenic m im icry of imp lanted human pancreatic cancer in nude m ice. Methods Human pancreatic cancer SW-1990 cells were inoculated subcutaneously in nude m ice.The tumor bearing nude m ice were divided into four g roups w ith 7 m ice in each g roup.The animals were injected intraperitoneally w ith saline control,5 mg/kg,10mg/kg and 20mg/kg ginsenosides Rg3 for 4 wk,respectively.The animals were sacrificed 3d after com p letion of the treatment.The weight and size of xenog rafts were measured,the vasculogenic m im icry was observed by immunohistochem istry w ith CD31/PAS staining,and the m RNA/p rotein exp ressions of VE-Cadherin,EphA2, MMP-2,MMP-9 were detected by fluorescent RT-PCR and Western b lot,respectively. Results Ginsenosides Rg3 significantly inhibited weight and size of transp lanted tumors;and inhibited vasculogeic m im icry.The exp ression of VE-Cadherin,EphA2,MMP-2 and MMP-9 mRNA and p rotein were down-regulated.Conclusion Rg3 can inhibitvasculogenic m im icry of transp lanted human pancreatic cancer in nude m ice,which may be associated w ith the down-regulation of VE-Cadherin,EphA2,MMP9 and MMP2 exp ression.

Subcutaneous transp lantation tumor Vasculogenicm im ic ry VE-cadherin EphA2 MMP-2 MMP-9

2016-04-14）

（本文编辑：李媚）

323000 丽水市中心医院肝胆外科（郭敬强）；浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科（林胜璋）

林胜璋，E-mail：w zfz l sz@163.com