陈芳+朱斌++周萍

[摘要]目的 探讨母血中胎儿游离DNA进行地中海贫血的无创产前诊断价值。方法 选取我院2014年6月～2016年1月的10例地中海贫血妊娠妇女为研究对象，与传统的羊水穿刺诊断进行比较，采用孕妇外周血血中胎儿游离DNA高通量测序诊断，分析高通量测序方法的检出率、误诊率、漏诊率。结果 胎儿游离DNA高通量测序的检出率、误诊率及漏诊率分别为90.0%（9/10）、0.0%（0/10）和10.0%（1/10），与金标准比较基本一致，可以用于地中海贫血的诊断。结论 胎儿游离DNA高通量测序可以用于地中海贫血的无创产前诊断，对临床有一定的指导及应用意义。

[关键词]游离DNA；地中海贫血；高通量测序

[中图分类号] R556.6+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（a）-0111-03

[Abstract]Objective To study the value of non invasive prenatal diagnosis of fetal free DNA in maternal blood.Methods From 2014 January to 2016 January，10 cases of pregnant women with thalassemia patients were selected as the research object.Compared with the traditional diagnosis of amniotic fluid puncture，the detection rate of fetal free DNA in peripheral blood of pregnant women was analyzed，and the detection rate，misdiagnosis rate and missed diagnosis rate of high throughput sequencing method were analyzed.Results Two methods of detection rate，misdiagnosis rate，missed diagnosis rate，fetal free DNA high-throughput sequencing detection rate，the rate of misdiagnosis and missed diagnosis rate were 90.0% （9/10），0.0% （0/10） and 10.0% （1/10），compared with the gold standard was basically consistent，which was used for the diagnosis of Mediterranean anemia.Conclusion High accuracy rate of non invasive prenatal diagnosis of Mediterranean anemia using fetal free DNA sequencing，it can be used for the detection of Mediterranean anemia.

[Key words]Free DNA；Mediterranean anemia；High throughput sequencing

地中海贫血属于单基因遗传性的一种慢性溶血病[1]，主要是珠蛋白基因缺失与突变抑制珠蛋白血红蛋白肽链的合成，打破肽链平衡[2-3]。在流行病调查过程中发现：α地中海贫血基因的携带率为6.0%～7.3%，β地中海贫血基因的携带率为1.83%～3.36%，严重影响了新生儿的身体健康，造成患儿严重贫血或夭折[4-5]。笔者收集我院收治的10例妊娠妇女的临床资料，并抽取孕妇的外周血以进行诊断与筛查，分析孕妇外周血胎儿游离DNA应用于α地中海贫血产前诊断的效果，并与金标准进行比较，从而确定胎儿游离DNA高通量测序的准确性。现将研究过程与研究结果汇报如下。

1资料与方法

1.1一般资料

纳入标准：2014年6月～2016年1月于我院产前诊断遗传咨询门诊就诊的妊娠妇女，夫妻双方地中海贫血基因检测结果显示为α轻型地中海贫血，均需实施介入性产前诊断明确胎儿地中海贫血基因。排除合并其他疾病的患者，排除患有严重其他器官疾病者。患者知情并愿意参加本次研究。其中年龄20～40岁，平均（29.7±2.5）岁，孕龄13～22周，平均（16.2±1.2）周。

1.2方法

知情告知后，采取孕妇静脉血5 ml，并进行EDTA抗凝，通过常规方法进行基因DNA的提取，并在50 μl TE溶液的辅助下进行DNA提取，利用PCR-RDB法判断α地中海贫血基因与突变位点。

1.2.1胎儿游离DNA的提取 静脉血收集后，进行离心，并将分离后血浆存在离心管中，以13 000 r/min再次进行离心，去除上清，按照试剂盒说明书进行操作，通过采样柱分离法提取DNA，洗脱液选择天根生化科技（北京）有限公司提供的1%琼脂糖凝胶，并对低于300 bp的DNA进行回收[6]。

1.2.2高通量测序中PCR扩增法 引物为F：5′-TATCATGCCTCTTTGCACCATTC-3′；5′-GGCCTAGC？鄄TTGGACTCAGA-3′，211 bp是产物长度，其中涵盖α珠蛋白基因（HBA1，HBA2）中的突变位点。在反应体系中，上游引物2 μl，下游引物2 μl，buffer 5 μl×10，Taq DNA酶1 μl，DNTP 4 μl，模板5 μl，双蒸水50 μl，于94℃环境中实施5 min预变性，然后以94℃变性30 s，56℃处理30 s，72℃处理1 min的模式进行循环，结束后再于72℃处理5 min。待聚合酶链式反应结束后，模板选择3 μl产物，实施扩增，与首次保持一致，最后体积为50 μl[7-8]。

1.2.3高通量测序信息分析 原始数据去掉公共测序接头序列，使用SOAP2进行全目标区域比对，并评价捕获特异性及覆盖度；去除重复区域；使用SOAPsnp对基因组测序数据进行SNP信息分析；通过2+1核心家系组合，得到父亲及母亲的单体型信息；通过父亲及母亲都是纯合但基因型不同的位点计算血浆中胎儿DNA浓度；通过父母单体型信息，根据血浆中的碱基分布，计算得到胎儿的单体型重组信息；通过比较胎儿的单体型是否携带致病基因，确定胎儿是否患病或携带致病基因[9]。

1.2.4羊膜腔穿刺法 孕妇术前知情告知，排空膀胱，常规消毒铺巾，于B超引导下抽取羊水15 ml送检胎儿地中海贫血基因。获取胎儿地中海贫血基因结果。

1.3评价指标

以羊水穿刺结果为金标准，计算高通量测序方法的检出率、误诊率、漏诊率。

2结果

羊水穿刺结果提示：3例水肿胎，3例HbH病，2例轻型地贫携带者，2例地中海贫血基因完全正常。以羊水穿刺结果为金标准，胎儿游离DNA高通量测序的结果中有9例与羊水穿刺结果相同，其中1例羊水穿刺结果提示AA/aa，而高通量测序结果显示为正常。故其检出率、误诊率及漏诊率分别为90.0%（9/10）、0.0%（0/10）和10.0%（1/10），与传统的羊水穿刺诊断比较，胎儿游离DNA高通量测序诊断地中海贫血的检出率较高，对临床有一定的指导意义及应用意义，且高通量测序方法具有无创性。

3讨论

α地中海贫血具有危害大、发病率高等特征[10]，轻型地中海贫血无需治疗，重型患者需要长期输血，且多在幼年夭折，因此α地中海贫血的产前筛查极为重要[11-12]。我国医疗技术不断发展，产前诊断技术较为完善，但仍有风险。羊膜腔穿刺、脐带穿刺等有影响胎儿正常生长发育的风险，且会加重孕妇的心理压力[13-14]。

在早期，通过孕妇外周血胎儿游离DNA高通量测序检测β地中海贫血的相关文献资料较少，其已被报道的机制如下[15-18]：①胎儿细胞利用胎盘进入母血中，受母体免疫系统的影响，胎儿细胞DNA会进入母体血浆；②胎儿细胞发生凋亡；③胎盘滋养细胞发生凋亡。孕妇外周血进行胎儿DNA的分离具备快速、简易、经济等特点，在保证检测方法高效性、特异度与敏感度等的同时，简化操作技术的条件，可在临床检测中大范围地推广应用。但是该方法无法避免母体DNA对孕妇外周血胎儿游离DNA检测结果的干扰，导致PCR技术假阳性、假阴性等问题的存在。

研究报道指出，妊娠超过6周后，就可实施胎儿游离DNA的检测，且其浓度随着孕周的增加而上升，但是在孕妇分娩几小时后消失[19-22]。因此孕妇外周血胎儿游离DNA检测属于一种新型的产前诊断无创技术，能够有效提高α地中海贫血胎儿游离DNA高通量测序的准确率。本研究结果显示，采用胎儿游离DNA高通量测序得到检出率为90.0%，1例患者发生漏诊，漏检率为10.0%，发生漏诊的原因可能是在样品采集、建库及上机分析等过程中出现，从而导致胎儿游离DNA高通量测序的漏诊，且在实际的操作中也可能出现误差，从而出现误诊的几率也会升高，因此在诊断检测过程中进行5个以上的平行分析，可以减少误差，在今后的研究中注意在检测的整个过程中漏诊情况的发生。本实验因经费情况，纳入病例较少，如果增加样本量，应可以大大降低其漏诊率。胎儿游离DNA高通量测序是一种无创技术，对胎儿无损伤，对临床有一定的指导意义，望以后能行大样本的研究以证实方法学的稳定性。

综上所述，采用胎儿游离DNA高通量测序进行地中海贫血的无创产前诊断具有一定的临床应用价值。

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（收稿日期：2016-07-25 本文编辑：王红双）