刘天红，李红艳，吴志宏，李 晓，孙元芹，卢 珺，姜晓东，王 颖

( 山东省海洋生物研究院，山东 青岛 266100 )

响应面法优化罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除技术研究

刘天红，李红艳，吴志宏，李 晓，孙元芹，卢 珺，姜晓东，王 颖

( 山东省海洋生物研究院，山东 青岛 266100 )

利用紫外分光光度计全扫描模式确认罗氏海盘车生殖腺皂甙检测波长，利用响应面法对生殖腺皂甙脱除条件进行优化。利用响应面Box-Bohnken法优化生殖腺皂甙脱除条件，各条件取整数，超声时间13 min、乙醇体积分数4.5%、脱除次数2，进行3次验证试验，残渣中皂甙平均含量为0.094 mg/g，与模型预测值接近，与处理前0.325 mg/g对比，脱除率达72.3%，说明海盘车生殖腺皂甙脱除模型建立成功。

海星生殖腺;皂甙脱除;超声波脱除

罗氏海盘车(Asteriasrollestoni)，属棘皮动物门、海星纲、钳棘目、海盘车科[1]。我国沿海有100多种，黄、渤海常见种类有多棘海盘车(A.amurensis)、罗氏海盘车、陶氏太阳海星(Solasterdawsoni)等[2-3]。海星为肉食性动物，繁殖能力和再生能力很强，喜爱吞食各种软体动物、棘皮动物等，对沿海扇贝、牡蛎、贻贝、鲍鱼等贝类养殖业具有较大危害[4]。海星的生殖腺味道鲜美，但含有皂甙[5-6]，限制其多途径的高效利用及产业化开发。王兵等[7]从南海海星(Craspidastethesperus)中分离提取了总皂苷，并进行抗肿瘤活性研究，结果发现海星总皂苷能明显抑制小鼠生肉瘤S180的生长，延长H22腹水小鼠的生存时间，说明海星总皂苷具有显著的抗肿瘤活性，可望用于恶性肿瘤的治疗;郭承华等[8-10]研究了罗氏海盘车的皂甙制备方法，对其性质进行鉴定，并进行其组织中海星皂甙分布及活性的研究；文震等[11-12]对不同方法制备的海星皂甙进行细胞毒性评价，考察超临界CO2萃取、乙醇萃取两种方法制备的南海产多棘海星皂甙的溶血过程，采用分光光度法测定溶血指数，结合红细胞形态学观察，评价其细胞毒性，结果显示，两种方法制备的海星皂甙均具有明显溶血作用，超临界CO2萃取、溶剂萃取的海星皂甙溶血指数分别为19 231、12 821，超临界CO2萃取的海星皂甙保持了更强的细胞毒性，这为海星皂甙制备工艺的选择，探索其物质基础提供了参考依据。笔者利用响应面法优化罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除条件，以期为罗氏海盘车变废为宝、变害为利，提供有效的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)人参皂甙标准品Rg1：CAS号,41753-43-9，纯度≥98%，分子量1109.29；(2)罗氏海盘车:2013年5月采自青岛八大峡海域，取其生殖腺；(3)医用酒精；(4)甲醇A.R.级；(5)UV2450 紫外分光光度计(岛津公司)。

由于罗氏海盘车生殖腺脱毒后，需应用于食品和饲料开发，故脱毒剂不能采用强酸、强碱或其他有机试剂，使用超声提取与乙醇提取相结合的脱除方式。

1.2 罗氏海盘车皂甙标准曲线绘制

1.2.1 皂甙溶液配制

称取适量人参皂甙和自制罗氏海盘车粗皂甙粉末(1.2.4)分别溶于甲醇中，制得质量浓度为0.5 mg/mL的人参皂甙溶液和罗氏海盘车皂甙溶液。

1.2.2 人参皂甙与罗氏海盘车皂甙溶液全扫描对比

分别取1 mL人参皂甙溶液和罗氏海盘车皂甙溶液放入10 mL比色管挥干试剂，加入2 mL浓硫酸，迅速置于60 ℃水浴60 min，流水冷却后定容至10 mL，UV2450全扫描。

1.2.3 标准曲线绘制

分别移取0、0.1、0.3、0.5、0.7、1 mL皂甙溶液至10 mL比色管挥干试剂，加2 mL浓硫酸，迅速置于60 ℃水浴60 min，流水冷却后定容至10 mL，波长282 nm处测吸光值绘制标准线。

1.2.4 皂甙提取检测

参考文献[9，13]的检测方法，将全部生殖腺加入300 mL的85%的乙醇超声10 min，抽滤后保留滤液，滤渣重复上述过程2次，合并滤液，减压浓缩至50 mL，加入等体积的蒸馏水，加入3倍体积的石油醚脱脂，用水饱和正丁醇对水层萃取，减压浓缩得皂甙浸膏，冻干得到粗皂甙粉末，制成罗氏海盘车皂甙溶液，在波长282 nm下检测吸光值，按标准曲线折算为皂甙含量。

1.2.5 不同处理条件对罗氏海盘车皂甙脱除的影响

(1)超声波时间对罗氏海盘车皂甙脱除的影响

取新鲜罗氏海盘车生殖腺，加入300 mL体积分数为 3%的乙醇分别超声5、10、15、20 min，抽滤后保留滤渣，滤渣重复上述过程2次，留取滤渣按1.2.4检测皂甙。

(2)乙醇体积分数对罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除的影响

取罗氏海盘车生殖腺，分别加入300 mL体积分数为 1%、3%、5%、7%的乙醇，超声10 min，抽滤后保留滤渣，滤渣重复上述过程2次，留取滤渣按1.2.4进行检测皂甙。

(3)抽提次数对罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除的影响

取罗氏海盘车生殖腺，加入300 mL体积分数为 3%的乙醇，超声10 min，抽滤后保留滤渣，滤渣重复上述过程2次、3次、5次，留取滤渣按1.2.4进行检测皂甙。

1.2.6响应面法优化罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除条件

选择超声波时间、乙醇体积分数、抽提次数作为影响罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除主要因素，按照响应面法设计，每个因素取3个水平，以残渣中皂甙的含量为响应值，利用响应面经验模型，建立最优脱除条件。试验水平和因素设计见表1。

图1 人参皂甙标准品Rg全扫描图谱

图2 罗氏海盘车皂甙全扫描图谱

图3 人参皂甙标准品Rg和罗氏海盘车皂甙全扫描图谱重叠图

2 结果与分析

2.1 人参皂甙和罗氏海盘车粗皂甙全波长扫描

人参皂甙Rg和罗氏海盘车皂甙分别在波长283 nm处有响应值，并且二者均为浓硫酸水浴法，与文献[13]海星皂甙在波长282 nm处有响应值较为接近，故选定282 nm作为检测波长(图1～图3)。利用人参皂甙作为标准品，按照皂甙提取检测方法测得新鲜罗氏海盘车生殖腺粗皂甙含量为0.325 mg/g(图1～图3)。

2.2 单因素对罗氏海盘车皂甙脱除的影响

罗氏海盘车生殖腺脱除残渣中的皂甙含量随着超声波时间的延长、乙醇体积分数的增加、提取次数的增加而降低(图4)；超声波时间对残渣中皂甙含量影响极其显著(P<0.001)，乙醇体积分数、提取次数对残渣中皂甙含量影响显著(P<0.05)(图5)；乙醇体积分数越高和提取次数越多，脱除效果越好，但在实际研究中，考虑到时间和成本问题，故在响应面优化时各条件见表1。

图4 超声波时间、乙醇体积分数、提取次数对海星生殖腺皂甙脱除效果的影响

2.3 响应面法优化罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除条件

用Design Expert 8.0优化乙醇体积分数、超声波时间、提取次数对罗氏海盘车皂甙脱除的影响，按照响应面设计法每个因素取3个水平，以残渣中海星皂甙含量为响应值，进行数据分析，并建立二次响应面经验模型，确定罗氏海盘车皂甙最佳脱除条件(图5)。试验因素水平设计及结果见表1。

图5 乙醇体积分数、超声波时间与提取次数的响应面

运行编号A:超声时间/minB:乙醇体积分数/%C:抽提次数皂甙含量/mg·g-115.003.002.000.293210.001.004.000.218310.003.003.000.075410.005.002.000.068510.003.003.000.063610.003.003.000.077715.003.004.000.052815.003.002.000.103910.003.003.000.087105.003.004.000.2661115.001.003.000.2471210.005.004.000.0811315.005.003.000.0841410.001.002.000.218155.001.003.000.3131610.003.003.000.080175.005.003.000.290

2.4 方差分析

利用软件对试验结果进行二次多元回归拟合，对表1的数据进行方差分析后得到模型的二次多元回归方程为：

皂甙含量=0.060-0.093×A-0.072×B-0.017×C-0.047×A×B-0.011×A× C-9.250E-003×B×C+0.10×A2+0.060×B2+0.013×C2

表2 方差分析

通过Design Expert 8.0软件对回归方程求解，在试验的因素水平范围内预测罗氏海盘车皂甙最佳脱除条件为：超声时间13.31 min、乙醇体积分数4.41%、脱除次数2.30，残渣中皂甙含量0.080 mg/g。在此条件下，各条件取整数，超声时间13 min、乙醇体积分数4.5%、脱除次数2次，进行3次验证试验，残渣中皂甙平均值为0.094 mg/g，与模型预测值接近，与处理前0.325 mg/g对比，脱除率达72.3%，说明罗氏海盘车皂甙脱除模型建立成功。

3 讨 论

3.1 浓硫酸水浴法测定不同来源的皂甙

文中采用的是人参皂苷Rg1 作为罗氏海盘车皂甙检测的标准品，人参皂甙属于四环三萜类化合物, Rg1是原人参三醇型皂苷[14]的一种，该化合物与浓硫酸在一定的温度下呈现粉色，在λ=283 nm有响应值，笔者提取的罗氏海盘车粗皂甙利用浓硫酸水浴法所呈现的现象与人参皂苷Rg1一样，且在λ=282 nm有响应值。已有研究表明海星皂甙是海星主要的次级代谢产物，由糖原和苷元两部分组成[15]，部分苷元属于四环三萜类化合物，在浓硫酸和一定温度下反应后，在紫外光下有吸收值。

3.2 脱除剂选择和脱除效率

郭承华等[9]对比甲醇和乙醇提取罗氏海盘车总皂甙，产率分别是0.09%和0.11%，由此可见，乙醇的提取效率更高一些；并且利用甲醇为提取剂从罗氏海盘车(烟台，3～6月)提取皂甙0.503 mg/g，高于本研究的0.325 mg/g，可能和地域差异引起个体差异有关，但甲醇提取可能会在生殖腺后续食品加工中有残留，影响食品品质。因本研究最终目的是将罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除后用于食品开发，所以，只能选择乙醇作为脱除剂。滕瑜等[16]利用淡碱对海星生殖腺进行脱毒，但没有提及脱除效果。王长云等[4]利用自配的0.2%～0.3%脱麻辣及脱毒效果溶液对多棘海盘车生殖腺进行脱毒效果较好，认为麻辣味已基本消除(综合评分由A降为E)，而粗总皂甙含量由0.077%降至0.026%，下降66.23%，与本研究的脱除率72.3%，较为接近，说明本方法有效。

3.3 超声处理对罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除影响

超声波能产生强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，造成细胞膜或细胞波的破坏，可加速有效成分进入溶剂，有利于目标成分的提取[17-18]。超声波处理时间对罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除影响极其显著，超声10 min罗氏海盘车皂甙含量较5 min时下降约2倍，这与其他学者研究中将超声波作为提取有效成分的关键因素进行优化一致[19-21]。

4 结 论

(1)通过全扫描发现罗氏海盘车皂甙在波长为282 nm处有响应值，与人参皂甙的响应值较接近，可用人参皂甙标准品绘制标准曲线；

(2)通过Design Expert 8.0软件对回归方程求解，在试验因素水平范围内预测罗氏海盘车皂甙最佳脱除条件为：超声时间13.31 min、乙醇体积分数4.41%、脱除次数2.30，残渣中皂甙含量0.080 mg/g。在此条件下，各条件取整数，超声时间13 min、乙醇体积分数4.5%、脱除次数2，进行3次验证试验，残渣中皂甙平均值为0.094 mg/g，与模型预测值接近，与处理前0.325 mg/g对比，脱出率达72.3%，说明响应面法优化罗氏海盘车生殖腺皂甙脱除模型建立成功。

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OptimizationofRemovalofSaponinsinGonadofStarfishAsteriasrollestonibyResponseSurfaceAnalysis(Box-Bohnken)

LIU Tianhong, LI Hongyan,WU Zhihong, LI Xiao, SUN Yuanqin, LU Jun,JIANG Xiaodong, WANG Ying

( Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266100, China )

A full scan of ultraviolet spectrophotometer was applied to detect gonad saponins of starfishAsteriasrollestoni, and then removal conditions of the saponin were optimized by response surface method. Conditions of utilizing response surface method Box-Bohnken were approximated to integer of ultrasonic time of 13 min, ethanol concentration of 4.5%, and removal times of 2. Three verification experiments under these conditions revealed that there was average saponins content of 0.094 mg/g in residues, approximated to the predicted figure of the model. Contrast to the 0.325 mg/g before, there was a removal ratio of 72.3%, indicating that the model of gonads saponin removal was established in success.

Asteriasrollestonigonad； saponin removal； ultrasonic removal

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.006

S985.9

A

1003-1111(2016)06-0639-05

2015-11-18；

2016-02-22.

国家海洋局资助项目(201205027)；山东省科技厅资助项目(2012GHY11516).

刘天红(1982—)，女，助理研究员；研究方向：水产品安全与质量控制. E-mail：oucthl@126.com. 通讯作者：王颖(1971—)，女，研究员；研究方向：食品科学与工程. E-mail：yzsshipin@126.com.