陈苏，单岳，晁雷，姜鹏艳，郑尧文，唐章，王皓，姜秋萍，屈登鑫

1. 沈阳大学环境学院//区域污染环境生态修复教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110044；2. 沈阳建筑大学市政与环境学院，辽宁 沈阳 110168

表面活性剂-微生物联合修复滴滴涕污染土壤的研究

陈苏1，单岳1，晁雷2，姜鹏艳1，郑尧文1，唐章1，王皓1，姜秋萍1，屈登鑫1

1. 沈阳大学环境学院//区域污染环境生态修复教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110044；2. 沈阳建筑大学市政与环境学院，辽宁 沈阳 110168

以滴滴涕（DDT）为目标污染物，采用课题组前期研究所筛选出的滴滴涕降解菌——甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）菌液为供试菌液，选取混合表面活性剂［十二烷基苯磺酸钠（SDBS）和吐温80（Tween80），比例为2∶3］及生物表面活性剂-鼠李糖脂（RL）作为供试表面活性剂，通过田间小区实验，研究了表面活性剂、DDT降解菌对土壤中DDT的去除、降解情况以及两者联合处理对土壤中DDT污染的修复效果。结果表明，在单独添加表面活性剂的处理中，H300、RL5和RL10的处理效果最好，土壤中DDT的降解率最高可达29.60%。单独接种降解菌处理的土壤中DDT残留量显著减少，5个月后降解率可达47.05%。混合表面活性剂与菌株联合处理1个月后，H70+N的DDT降解率最高，可达63.53%；生物表面活性剂-降解菌处理以RL20+N的DDT降解率最高，可达42.32%。随着处理时间延长，表面活性剂与菌株联合处理土壤中DDT降解率的增幅逐渐下降。在处理5个月后，混合表面活性剂-降解菌的处理中以H70+N的DDT降解率最高，可达63.98%；生物表面活性剂-降解菌的处理中以RL20+N的DDT降解率最高，可达45.64%；混合表面活性剂-降解菌的处理效果略优于生物表面活性剂+菌，其中H70+N的处理效果最好，为63.98%。

滴滴涕；污染土壤；表面活性剂；微生物；修复

根据 2011年 10月的全国人大常委会会议报告，我国现有的1.2×.28hm-2耕地中，受农药污染的约有9.33×107hm-2，总体的土壤环境质量不容乐观（Kishimba et al.，2004）。据报道，我国约有20%的土地受到了不同程度的污染，污染物包括有机氯污染中的主要污染物DDT（Kishimba et al.，2004；王涛，2014）。国内农田耕地土层中 DDT总体残留量为0.22～0.27 mg∙kg-1。我国部分地区农田土壤所含的OCPs情况如表1所示，其中北京、天津、南京等地DDT污染的水平尤为严重，分别达到了2178.55、972.24、1050.70 ng∙g-1（王涛，2014；Cavanagh et al.，1999；Harner et al.，1999）。此外，苏南地区土壤中 DDT的污染水平达到 100～1200 ng∙g-1（Schippers et al.，2000），苏北棉区土壤中DDT污染水平竟高达1500 ng∙g-1（安琼等，2004）。坦桑尼亚、澳大利亚昆士兰州、美国阿拉巴马州等地区土壤 DDT的污染水平分别为 20.40、21.20、 517.3 ng∙g-1（Cavanagh et al.，1999；Harner et al.，1999；Schippers et al.，2000）。

表1 国内部分地区农田土壤OCPs污染水平Table 1 Soil OCPs pollution levels in some areas of China ng∙g-1

虽然我国早在 1983年禁止使用有机氯农药，但农田土壤中有机氯污染物因具有持久难降解等特点仍有较高的残留，其通过农产品对人体健康造成的潜在风险已经成为我国环境安全领域的关注热点之一（Wong et al.，2002；屈伟月，2007；陈耀华等，2006）。与此同时，我国人口众多，可利用土地不断减少，虽然有机氯农药曾为世界粮食生产做出了重大贡献，但土壤中残留的有机污染物（如农药、多环芳烃、多氯联苯等）会破坏土壤-植物系统的正常运转，通过直接暴露或食物链（网）传递而威胁人类和生物体的健康和环境的安全。近年来，由于我国推进城市化步伐的加快，城市面积不断扩大，大量工厂企业外迁（张春玲等，2014），由此而产生的大量工厂旧址如农药厂所产生的高浓度有机氯污染物则需要治理修复，以保证土地资源的持续高效利用（熊雪丽等，2012）。因此，亟需开发经济、安全、高效的土壤污染治理与修复的实用技术，以保障土壤-植物系统的生态环境安全，实现农业清洁生产和土地资源持续利用。

对于受到有机氯农药滴滴涕污染的土壤，如何进行修复与再利用，恢复其生产能力，改善其环境功能，市场对这些方面的需求是非常巨大而迫切的。开展有机氯农药污染场地土壤修复十分重要、刻不容缓。微生物降解是有机物污染土壤修复的有效方法。由于有机污染物具有生物毒性、疏水性，易被土壤颗粒及有机质吸附等特点，其微生物降解过程易受到限制。因此，通过寻找高效降解菌来提高土壤中有机物的溶解性，增加其生物利用性，已成为有机物污染土壤微生物修复的关键。而表面活性剂同时具有亲水和疏水基团，可显著增强有机污染物的增溶效果，提高其生物利用性，从而促进微生物的降解，这对微生物修复具有良好的调控作用。众多学者利用原位修复和异位修复技术及生物表面活性剂对污染土壤进行了大量的修复工作，如钱春香等（2013）利用微生物修复技术使污染土壤中的重金属含量显著减少；杨慧娟等（2015）研究了皂角苷等3种生物表面活性剂对土壤中六六六、滴滴涕、乙草胺等的去除作用，结果表明3种表面活性剂对上述有机污染物均有一定增溶效果；田齐东等（2012）利用3种表面活性剂，比较不同表面活性剂处理对土壤中有机氯农药的洗脱效应，并对有机氯农药污染场地土壤进行洗脱修复，证明不同的表面活性剂对有机氯农药的去除效果虽然不同但却都很显著；Tween60和SDS强化白腐真菌修复DDTs污染土壤的研究表明，将两种类型的表面活性剂组合后对提高DDTs的生物可利用性产生了协同效果，研究还发现菌株接种量越高，土壤中DDTs的降解去除率越高，这进一步证实了利用表面活性剂强化白腐真菌修复有机污染土壤的可行性。

本论文在前期的研究基础上，以滴滴涕为目标污染物，针对东北地区设施农业中滴滴涕污染土壤进行表面活性剂与微生物的单独修复及联合修复研究，并确定其修复效果与效率，旨在为滴滴涕污染土壤的防治和农产品安全生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验地点：沈阳市沈北新区设施农业的大棚内，采用田间实验方式，实验小区设置为1 m×1 m。

供试土壤：草甸棕壤；pH 7.10，有机质54.37 g∙kg-1，阳离子交换量 13.09 cmol∙kg-1，土壤容重1220 kg∙m-3；砂粒 1.07%，粉粒 72.82%，粘粒26.11%；土壤中滴滴涕含量为47.94 μg∙kg-1。

表面活性剂：采用2种类型的表面活性剂，一种是混合表面活性剂，即十二烷基苯磺酸钠（SDBS，国药集团化学试剂有限公司）和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（Tween80，国药集团化学试剂有限公司），其混合比例为2∶3；另一种是生物表面活性剂鼠李糖脂（RL，纯度约90%，湖州紫金有限公司）。

供试菌株：采用前期实验研究所筛选出的对滴滴涕具有良好降解效果的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）菌液，其中细菌菌落形成单位为1×108mL-1。该菌株已经保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号：12461。

1.2 实验设计

共设置3组处理：

（1）表面活性剂处理：在实验小区土壤的0～20 cm表层土中施入不同剂量的混合表面活性剂（使用剂量分别为0、40、70、100、200、300 mg∙kg-1，分别记作CK、H40、H70、H100、H200、H300）、生物表面活性剂鼠李糖脂（使用剂量分别为0、5、10、20 mg∙kg-1，分别记作CK、RL5、RL10、RL20），混匀。保持田间持水率为 50%～60%，分别在实验开始后的1个月、3个月、5个月取土样，监测土壤中滴滴涕的含量，每个样品3次重复。

（2）微生物菌液处理：在实验小区污染土壤的0～20 cm 表层土中接种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）菌液，菌液接种量为500 mL∙m-2，菌落形成单位为1×108mL-1。添加菌液的处理记作N，未添加菌液的处理记作CK。保持田间持水率为50%～60%，分别在实验开始后的1个月、3个月、5个月取土样，监测土壤中滴滴涕的含量，每个样品3次重复。

（3）表面活性剂-微生物联合处理：在实验小区污染土壤的0～20 cm表层土中接种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）菌液500 mL∙m-2，菌落形成单位为1×108mL-1，并施入不同剂量的混合表面活性剂（使用剂量分别为0、40、70、100、200、300 mg∙kg-1，分别记作CK、H40+N、H70+N、H100+N、H200+N及H300+N处理）、生物表面活性剂鼠李糖脂（使用剂量分别为 0、5、10、20 mg∙kg-1，分别记作CK、RL5+N、RL10+N及RL20+N处理），混匀。保持田间持水率为 50%～60%，分别在实验开始后的1个月、3个月、5个月取土样，监测土壤中滴滴涕的含量，每个样品3次重复。

1.3 测试方法

土壤基本理化性质按土壤农化常规分析法测定（鲁如坤，2000）。

土壤中滴滴涕的提取采用加速溶剂萃取法（张岩等，2010），加速溶剂萃取（ASE）是在较高的温度和压力下用少量的有机溶剂从固体、半固体中萃取有机物的前处理技术（李国华等，2015）。萃取后的溶液参照《土壤中六六六和滴滴涕测定的气相色谱法（GB/T 14550—2003）》（GB/T 14550—2003，2003）使用浓硫酸磺化法对萃取液进行净化，并采用气相色谱法进行测定，测试条件：色谱柱采用 CP-sill 8CB 型石英毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱温120 ℃（1 min）→230 ℃（25 ℃∙min-1，0 min）→255 ℃（3 ℃∙min-1，0 min）→280 ℃（20 ℃∙min-1，5 min）；进样口温度250 ℃；检测器温度 300 ℃；载气为高纯氮气，流速 0.6 mL∙min-1；尾吹30 mL∙min-1；进样量1 μL（不分流）；外标法定量，方法回收率89.2%～107.1%。

1.4 数据处理

所有试验数据采用Excel、SPSS 13.0进行计算和统计分析。

2 结果与分析

2.1 表面活性剂单独处理对土壤中滴滴涕的降解效果

2.1.1 不同表面活性剂处理下土壤中DDT的残留量

不同表面活性剂处理下，土壤中 DDT的残留情况如图1所示。从图1可知，与CK处理相比，混合表面活性剂或生物表面活性剂的添加对土壤中DDT的降解均有明显的促进作用。

就混合表面活性剂的添加 H40-H300处理而言，在实验开始1个月后，H40-H3005个处理的土壤中DDT的残留量为35.97～41.39 μg∙kg-1，其中H40和H300这2个处理的效果最好，土壤中DDT残留量分别为38.88 μg∙kg-1和35.97 μg∙kg-1；处理3个月后，H40-H3005个处理土壤中 DDT的残留量为35.18～38.54 μg∙kg-1，其中H300处理土壤DDT残留量为35.18 μg∙kg-1，而H40和H100处理土壤中DDT的残留量均为 38.54 μg∙kg-1。处理 5个月后，H40-H3005个处理土壤中 DDT的残留量为34.18～38.05 μg∙kg-1，随着时间的推移DDT降解幅度较小，基本处于稳定，而H70和H300处理的效果最好，土壤中 DDT残留量分别为 34.18 μg∙kg-1和36.39 μg∙kg-1。混合表面活性剂的5个处理中，H70和H300处理对土壤中DDT的降解有着最好的促进效果。

图1 表面活性剂处理下土壤中DDT的残留量Fig. 1 Residual amount of DDT in soil treated with surfactant

就添加量为5～20 mg∙kg-1的生物表面活性剂鼠李糖脂处理而言，在实验开始1个月后，RL5、RL10、RL203个处理土壤中DDT的残留量为35.06～41.02 μg∙kg-1，以RL5处理的效果最好，土壤中DDT残留量为35.06 μg∙kg-1；处理3个月后，RL5、RL5、RL203个处理土壤中DDT的残留量为33.81～38.54 μg∙kg-1，其中，RL10处理土壤的DDT残留量最低，为33.81 μg∙kg-1；在处理5个月后，RL5、RL5、RL203个处理土壤中 DDT的残留量为 33.75～38.46 μg∙kg-1，DDT降解较小，基本处于稳定，而RL10处理在生物表面活性剂鼠李糖脂的3种使用剂量中的处理效果是最好的。

通过比较混合表面活性剂与生物表面活性剂这两类处理可知，RL5、RL5、RL20这3个生物表面活性剂处理的土壤中 DDT的残留量普遍低于混合表面活性剂处理。

2.1.2 不同表面活性剂处理下土壤中DDT的降解率

不同表面活性剂处理下，土壤中 DDT的降解率如图2所示。从图2可知，实验开始后，混合表面活性剂处理土壤中DDT的降解率都在不断增加。生物表面活性剂降解效果最好的为RL10，5个月后降解率为29.6%。第1个月表面活性剂降解效果与CK相比，差异明显，第3个月的降解率增长幅度较小，第5个月降解效果不明显。

图2 表面活性剂处理下土壤中DDT的降解率Fig. 2 Degradation rate of DDT in soil treated with surfactant

CK空白处理下DDT的降解速度十分缓慢，降解率仅为3.59%；与CK相比较，添加混合表面活性剂的处理均明显提高了土壤中DDT的降解率。处理1个月后，表面活性剂处理对土壤中DDT的降解率为13.67%～26.88%；3个月后，土壤中DDT的降解率为19.61%～29.48%；5个月后，土壤中DDT的降解率为19.78%～29.60%。1个月、3个月及5个月的处理中土壤中 DDT的降解效果最好的处理均为H300，其降解效率分别为24.96%、26.61%及28.7%。随着处理时间的延长（1～5个月），土壤中DDT残留量呈下降趋势。添加生物表面活性剂的处理中，1个月处理 DDT的降解率为 14.44%～26.88%，其中RL20处理土壤的DDT降解率最高，为26.88%；3个月处理DDT降解率为19.62%～29.48%，其中RL10的降解率最高，为29.48%；5个月处理DDT的降解率为19.78%～ 29.6%，降解效率幅度较小，其中RL10的降解率最高，为29.60%。在添加表面活性剂的处理中，H300、RL5和RL10的处理效果最好，土壤中 DDT的降解率达 24.96%～ 29.60%。章瑞英等（2009）的研究证实所选的3种表面活性剂对DDT均具有一定的洗脱作用，且随着时间的延长，表面活性剂对土壤中DDT的洗脱效率逐渐增大。

2.2 微生物菌液单独处理对土壤中滴滴涕的降解效果

2.2.1 降解菌处理下土壤中DDT的残留量

图3 降解菌处理下土壤中DDT的残留量Fig. 3 Residual amount of DDT in soil treated with degrading bacteria

不同处理时间下，降解菌N菌株处理对土壤中DDT残留量的影响如图3所示。由图3可知，原土（即CK）在1个月、3个月及5个月时，DDT残留量均有小幅度降低，由初始实验的47.94 μg∙kg-1降至5个月后的46.22 μg∙kg-1，因为土壤中原有的少量土著微生物可降解低分子对 DDT具有自然降解效果；而加菌处理中随时间延长，土壤中DDT的残留量均显著降低，由实验初始的47.94 μg∙kg-1降至1个月后的28.60 μg∙kg-1，3个月后土壤DDT残留量降至26.90 μg∙kg-1，5个月后降至25.38 μg∙kg-1。从3个月与5个月的处理比较可知，土壤中DDT残留量变化很小，基本趋于平稳。微生物降解农药的方式主要有：（1）以农药为唯一碳源和能源生长，降解速度较快；（2）共代谢方式，微生物利用营养基质的同时将污染物降解（刘志培等，2015）。接种降解菌N菌菌液对土壤中 DDT的降解作用具有显著促进效果，故土壤中 DDT的残留量显著降低。随着接种时间的延长，降解菌对DDT的降解效果逐渐减弱并趋于平稳，这可能是因为刚刚接种降解菌后，菌株逐渐适应土壤环境和污染物胁迫并以DDTs为底物进行高效的分解代谢，此时DDTs降解效果明显，而随时间延长，微生物活性、数量会随营养物质的消耗而迅速下降，故DDTs的降解率逐渐趋于平缓。

2.2.2 降解菌处理下土壤中DDT的降解率

不同处理时间下，降解菌对土壤中DDT的降解率如图4所示。从图4可知，CK处理1～5个月中土壤DDT降解率变化较小，仅为1.27%～3.59%。N菌处理土壤中DDT的降解率要远远高于CK处理。实验1个月后，与CK相比，降解菌处理表现了非常显著的降解效果，土壤中DDT降解率为40.34%；3个月后，降解效率有小幅度提高，为43.89%；但5个月后，DDT的降解效果提高并不明显，其降解率是47.05%，降解幅度减小，基本趋于稳定。主要原因可能是随着时间推移，菌株的活性亦逐渐减弱。

图4 降解菌处理下土壤中DDT的降解率Fig. 4 Degradation rate of DDT in soil treated with degrading bacteria

2.3 表面活性剂-微生物联合处理下，土壤中滴滴涕的降解效果

2.3.1 表面活性剂与降解菌联合处理下土壤中DDT的残留量

在不同时间处理下，表面活性剂与降解菌联合处理下土壤的DDT残留量如图5所示。从图5可知，混合表面活性剂与菌株联合处理1个月、3个月及 5个月后，土壤中 DDT残留量分别为17.49～29.61、17.39～26.67、17.27～25.98 μg∙kg-1，其中效果最好的处理均为H70+N，其土壤中DDT残留量在1个月、3个月及5个月后分别为17.49、17.39及17.27 μg∙kg-1。由此可知，与单独添加降解菌和单独使用混合表面活性剂相比，混合表面活性剂-降解菌的联合处理对DDT的降解有协同作用。

图5 表面活性剂与降解菌联合处理下土壤中DDT的残留量Fig. 5 Residual amount of DDT in soil treated with surfactant and degrading bacteria

生物表面活性剂与菌株联合处理1个月、3个月及5个月后，土壤中DDT残留量分别为27.65～ 34.90、27.08～32.69、26.06～27.12 μg∙kg-1，其中效果最好的处理均为RL20+N，土壤中DDT残留量在1个月、3个月及5个月后分别为27.65、27.08及26.06 μg∙kg-1。

通过比较混合表面活性剂与降解菌联合处理同生物表面活性剂与降解菌联合处理这两类处理可知，H40+N、H70+N、H100+N这3个混合表面活性剂与降解菌联合处理土壤DDT的残留量普遍低于生物表面活性剂强化处理。

2.3.2 表面活性剂与降解菌联合处理下土壤中DDT的降解率

图6 表面活性剂与降解菌联合处理下土壤中DDT的降解率Fig. 6 Degradation rate of DDT in soil treated with surfactant and degradation bacteria

表面活性剂与降解菌N联合处理1个月、3个月及5个月后土壤中DDT去除率如图6所示。混合表面活性剂与菌株联合处理 1个月后，土壤中DDT的降解率为27.20%～67.53%，其中以H70+N处理的DDT降解率最高，可达63.53%；而生物表面活性剂-降解菌的处理中以RL20+N处理的DDT降解率最高，可达42.32%。随着处理时间延长，混合表面活性剂与菌株联合处理土壤中 DDT的降解率逐渐加大。在处理 5个月后，混合表面活性剂-降解菌处理中以H70+N处理的DDT降解率最高，可达 63.98%；生物表面活性剂-降解菌处理中以RL20+N处理的DDT降解率最高，可达45.64%；从5个月后土壤中DDT降解效果看，混合表面活性剂-降解菌的处理效果略优于生物表面活性剂-降解菌，混合表面活性剂-降解菌处理以H70+N的处理效果最好。

3 结论

（1）随着处理时间延长（1～5个月），土壤中DDT的残留量呈降低趋势。单一添加表面活性剂的处理中，H300、RL5和RL10的处理效果最好，土壤中DDT的降解率达24.96%～29.60%。

（2）加N菌处理均显著降低了土壤中DDT的残留量，其中N菌处理5个月后DDT降解率可达47.05%。

（3）混合表面活性剂与菌株联合处理1个月后，H70+N处理的DDT降解率最高，可达63.53%；在生物表面活性剂-降解菌的处理中RL20+N的DDT降解率最高，可达42.32%。随着处理时间延长，表面活性剂与菌株联合处理土壤中DDT降解率的增幅逐渐下降。在处理5个月后，混合表面活性剂-降解菌的处理中以 H70+N的 DDT降解率最高，可达63.98%；生物表面活性剂-降解菌的处理中以RL20+N的DDT降解率最高，可达45.64%；混合表面活性剂-降解菌的处理效果略优于生物表面活性剂-降解菌，其中H70+N的处理效果最好，为63.98%。

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Study on Surfactant-microorganism Combined Bioremediation of DDT Contaminated Soil

CHEN Su1, SHAN Yue1, CHAO Lei2, JIANG Pengyan1, ZHENG Yaowen1, TANG Zhang1, WANG Hao1, JIANG Qiuping1, QU Dengxin1

1. Key Laboratory of Regional Environment and Eco-Remediation, Ministry of Education//College of Environmental Sciences, Shenyang University, Shenyang 110044, China 2. College of Municipal and Environmental Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang 110168, China

In this paper, dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) is picked up as the target pollutant, DDT degradation bacteria -Bacillus methylotrophicus is picked up as tested bacteria, selection of mixed surfactants [twelve sodium dodecyl benzene sulfonate (SDBS) and Tween80, the ratio of 2∶3] and biological surfactant-rhamnolipid (RL) as the surfactants, through field experiment, the effects of single and combined treatments with the surfactant and bacteria on the removal of DDT in soil are studied. The results show that among the single surfactant treatments, the treatment effects of H300, RL5 and RL10 treatments are better, the best DDT degradation rate is 29.60%. The DDT residue in soil of bacteria treatment is significantly reduced and in 5 months later the DDT degradation rate is 47.05%. After 1 months in the mixed surfactant and strain combined treatments, the DDT degradation rate of H70+N is the highest which is up to 63.53%. DDT degradation rate of RL20+N is the highest in the biosurfactant-bacteria treatments which is up to 42.32%. With the increase of processing time, the DDT degradation rate amplitude of increase gradually decreased. In 5 months after the treatment of mixed surfactant and bacteria in the DDT degradation rate of H70+N is the highest which is up to 63.98%. In the biosurfactant-bacteria treatments, the DDT degradation rate of RL20+N is the highest which is up to 45.64%. The treatment effect of mixed surfactant-bacteria treatment effect is slightly better than that of biosurfactant-bacteria treatment, and the effect of H70+N is the best which is up to 63.98%.

dichlorodiphenyltrichloroethane; contaminated soil; surfactant; microorganisms; remediation

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.09.015

X53

A

1674-5906（2016）09-1522-06

陈苏, 单岳, 晁雷, 姜鹏艳, 郑尧文, 唐章, 王皓, 姜秋萍, 屈登鑫. 2016. 表面活性剂-微生物联合修复滴滴涕污染土壤的研究[J]. 生态环境学报, 25(9): 1522-1527.

CHEN Su, SHAN Yue, CHAO Lei, JIANG Pengyan, ZHENG Yaowen, TANG Zhang, WANG Hao, JIANG Qiuping, QU Dengxin. 2016. Study on surfactant-microorganism combined bioremediation of DDT contaminated soil [J]. Ecology and Environmental Sciences, 25(9): 1522-1527.

沈阳市计划（F14-133-9-00）；国家基础研究973项目（2014CB441106）；辽宁省科学技术计划项目（2014020164）；沈阳大学大学生创新训练计划（201611035000061）

陈苏（1979年生），女，副教授，博士，主要从事退化生态系统修复研究。E-mail: mailchensu@aliyun.com

2016-07-01