朱 翔，许 芳，王玉萍，付 夏，李书勤，李 莉，浦 春，武其文

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.检验科；2.妇产科；3.产前诊断中心，安徽 芜湖 241001)



·临床医学·

8606例中孕期妇女血清学三联筛查及产前诊断结果分析

朱 翔1，许 芳1，王玉萍1，付 夏1，李书勤2，李 莉3，浦 春1，武其文1

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.检验科；2.妇产科；3.产前诊断中心，安徽 芜湖 241001)

目的：探讨血清学三联指标联合产前筛查及产前诊断在临床上的应用价值。方法：应用时间分辨免疫荧光法对8606例孕中期妇女进行血清甲胎蛋白(AFP)、游离β-人绒毛膜促性腺激素(free-βHCG)和非耦联雌三醇(uE3)三联指标检测。将检测结果结合孕妇的年龄、孕周、体质量等因素输入中国南方人群数据库为基础的产前筛查风险评估软件计算出风险值。对染色体非整倍体病高风险者建议进行羊水穿刺细胞培养或荧光原位杂交试验进行产前诊断。低风险及拒绝进行羊水穿刺的高风险孕妇进行电话随访。结果：①8606例孕妇21-三体综合征(DS)、18-三体综合征(ES)和开放性神经管缺陷(ONTD)的筛查高风险阳性率分别为6.47%(557/8606)、0.17%(15/8606)和0.56%(48/8606)。②羊水细胞培养产前诊断共检出21-三体综合征8例，18-三体综合征2例。此外羊水细胞染色体核型分析还检出特纳综合征3例，克氏征1例以及染色体结构变异2例。③随访结果表明血清学三联法对21-三体综合征的检出率为84.62%，假阳性率为6.34%，假阴性率为0.02%。结论：孕中期妇女血清学三联指标联合产前筛查和羊水穿刺进行产前诊断对预防常见染色体综合征具有重要作用。

产前筛查；产前诊断；21-三体综合征；荧光原位杂交

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.017

出生缺陷是指胚胎或胎儿发育过程中由于遗传或环境等多种因素所导致的形态结构、生理功能以及代谢等方面的异常。我国是出生缺陷高发国家，据统计我国每年大约新增80万～120万例出生缺陷患儿，不仅给患者家庭和社会带来巨大压力，也严重影响我国的出生人口素质。因此，对孕期妇女进行产前筛查及诊断，以此来预防出生缺陷儿的出生便显得尤为重要。本研究对2012年6月～2014年10月于弋矶山医院产前诊断门诊就诊的8606例中孕期孕妇进行血清学三联指标(AFP、free-βHCG和uE3)产前筛查，并对染色体非整倍体高风险的孕妇进行产前诊断，现对结果作一回顾性分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2012年6月～2014年10月于弋矶山医院产前诊断门诊就诊且孕周在14～21+6周的孕妇8606例，年龄17～42岁，均来自安徽地区。月经周期规律者按末次月经时间计算孕周，月经周期不规律者按B超检查结果来确定孕周。

1.2 仪器和试剂 泰莱-Ⅱ型时间分辨荧光免疫分析仪为广州丰华生物公司产品，血清AFP、free-βHCG和uE3时间分辨检测试剂盒及其质控品来自广州丰华生物公司。产前筛查风险评估软件为广州丰华生物公司的PRsoft 2.0。羊水细胞培养基为美国欧文产品。Anuvysion荧光原位杂交检测试剂盒为美国生命科技有限公司产品。BX 51型荧光显微镜为日本Olympus产品，染色体核型分析系统为以色列ASI公司产品。

1.3 方法

1.3.1 三联指标血清学产前筛查 中孕期妇女签署产前筛查知情同意书后，空腹采集静脉血2～3 mL，4000 r/min离心10 min，吸取血清置于-20℃保存。采用时间分辨免疫荧光法检测孕妇血清中AFP、free-βHCG和uE3的浓度。检测步骤严格按照试剂盒操作说明书进行。检测结果结合孕妇年龄、体质量、孕周等因素，通过PRsoft 2.0产前筛查风险评估软件计算疾病发病风险。设定唐氏综合征高风险的cut-off值为1/270，>1/270 为高风险；18-三体综合征高风险的cut-off值为1/350，>1/350为高风险；根据AFP检测值中位数倍数(MOM值)判断神经管畸形风险，>2.5倍MOM值设为高风险。对21-三体和18-三体筛查结果为高风险的孕妇，在告知孕妇相应风险后，根据自愿原则行胎儿羊水细胞染色体核型分析或荧光原位杂交实验，以此来确诊。对低风险孕妇及未接受羊水穿刺的孕妇进行电话随访。

1.3.2 羊水穿刺产前诊断 在B超引导下行羊膜腔穿刺，弃去最初抽出的 2 mL羊水，然后抽取羊水20 mL进行细胞培养。将羊水注入2只15 mL无菌离心管中，每只10 mL，1000 r/min离心10 min，弃去上清，留0.5 mL，混匀后接种于2个细胞培养瓶中，每瓶加入4 mL 羊水培养基，轻轻混匀，静置于5%CO2培养箱中，温度37℃，培养6～7 d后更换培养液，继续培养1～2 d，此时镜下可见较多大而亮圆的分裂期细胞，可终止培养。每瓶加入秋水仙素4滴，37℃继续培养1 h。用吸管将培养瓶中的细胞转移到离心管中，1000 r/min离心10 min，弃去上清，保留细胞沉淀，经低渗、预固定、固定、再固定、次固定、滴片、烤片及显带等一系列处理后，在显微镜下观察结果。正常核型计数20个，分析5个，存取照片两张，异常核型计数40个。

1.3.3 间期羊水细胞荧光原位杂交实验 对于部分21-三体或18-三体高风险要求进行快速产前诊断的孕妇，利用Anuvysion荧光原位杂交试剂盒进行13、18、21号染色体的非整倍体检测。具体方法：①羊水标本的处理：标本离心，胶原酶消化28 min，老化(50℃ 4 h或室温过夜),RNA酶消化15 min，2×SSC漂洗，胃蛋白酶消化5 min，2×SSC漂洗，梯度脱水(70%、85%、100%乙醇，-20℃),室温干燥。②变性及杂交：70%甲酰胺73℃变性5 min，-20℃乙醇梯度脱水，加入已变性的探针杂交，封片，42℃湿盒内避光孵育10～12 h。杂交后洗片,DAPI染色15 min，镜检。③FISH信号观察：每个杂交区随机计数至少50个杂交细胞。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对本研究的数据进行统计学分析，计数资料的比较采用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清学产前筛查结果 8606例孕妇血清学筛查结果见表1。

表1 8606例孕中期妇女血清学三联筛查结果

疾病类别阳性切割值阳性例数阳性率%唐氏综合征1/2705576.4718-三体综合征1/350150.17开放性神经管缺陷2.5480.56合计/6207.20

2.2 羊水细胞培养染色核型分析 共284例高风险孕妇接受羊水穿刺进行产前诊断，其中260例进行了羊水细胞培养染色体核型分析。结果见表2、图1a～c。

a.21-三体综合征，核型分析结果：47，XY，+21，10×100；b.特纳综合征，核型分析结果：45，X，10×100；c.4号和15号染色体易位，核型分析结果：46，XX，t(4,15)，10×100。

图1 异常染色体核型分析图

表2 异常羊水细胞培养染色体核型分析结果

异常类型异常核型例数21-三体综合征47,XY,+21618-三体综合征47,XX,+182特纳综合征45,X2克氏征47,XXY1其他染色体结构畸变46,XX,t(4,15)146,X,t(X,17)1

2.3 未培养羊水细胞直接荧光原位杂交试验 本研究接受羊水穿刺的284例高风险孕妇有24例接受荧光原位杂交技术进行快速产前诊断，并同时进行了羊水细胞培养染色体核型分析。荧光原位杂交结果共检出21-三体综合征2例。随后核型分析验证结果符合率达100%。结果见图2。

细胞红色信号为21号染色体。

图2 2例21-三体综合征羊水细胞荧光原位杂交结果

2.4 随访结果 共有7986例产前筛查阴性及288例未接受羊水穿刺的高风险孕妇，共有8191例成功获得随访，随访率达99%。随访结果表明产前筛查21-三体低风险孕妇有2例出生了21-三体患儿。有3例未接受产前诊断的孕高风险孕妇出生了21-三体患儿。结合随访结果，计算本实验室利用血清学三联指标产前筛查对21-三体诊断的总检出率为84.62%，假阳性率6.34%，假阴性率为0.02%。

2.5 孕妇年龄与产前筛查的关系 本研究以35岁为分界点，将8606例孕妇分为两组,高龄组(≥35岁)共106例，筛查唐氏综合征阳性者30例，阳性率为28.3%；低龄组(<35岁)共8506例，筛查阳性者527例，阳性率为6.19%。高龄组阳性率明显高于低龄组，差异有统计学意义(χ2=84.58，P<0.01)。见表3。

表3 高龄组和低龄组孕妇唐氏综合征高风险率比较

预产年龄/岁n阳性例数阳性率/%<3585065276.2≥351063028.3*

3 讨论

唐氏综合征是新生儿中发病率较高的一种染色体疾病，发病率约为1/800～1/600[1]，是导致孕妇流产、死胎以及新生儿出生缺陷的常见原因之一。患者主要表现为严重的智力发育障碍，特殊面容，生长发育迟缓等。有文献报道，孕中期AFP、free-βHCG二联法筛查唐氏综合征的检出率为68%～86%，假阳性率为5%，而加入了uE3的三联法筛查可进一步降低假阳性率[2-4]。雌三醇是由胎儿肾上腺皮质和肝脏提供前体物质，最后由胎盘合成的一种甾体激素，以游离形式直接由胎盘分泌进入母体血循环。Muller[5]和Canick[6]均发现uE3在怀有唐氏综合征胎儿的孕妇血清中的浓度较正常孕妇偏低，所以测定孕妇血清uE3水平对唐氏综合征的筛查具有一定意义。我院采用AFP、free-βHCG、uE3的三联法检测孕中期妇女血清中的AFP、free-βHCG、uE3的浓度，筛查出唐氏综合征的高风险率为6.47%，与近几年国内报道的5.67%相比[7-8]，差异无统计学意义。

本研究发现高龄组孕妇(≥35岁)唐氏综合征高风险率明显高于低龄组孕妇(<35岁)，因此，年龄因素是引起唐氏综合征的高危因素之一。虽然唐氏综合征的高风险率与孕妇年龄的递增之间存在一定关联，但不能认为只有高龄孕妇才会孕育唐氏患儿。有关资料显示，大部分唐氏综合征患儿还是发生于低龄孕妇，所以不能仅仅对高龄孕妇进行产前筛查，而必须对所有孕妇进行筛查，以防漏筛。同时重点关注高龄孕妇，从而有效预防唐氏患儿的出生。

对筛查结果为高风险的孕妇，在告知孕妇相应风险后，本着自愿的原则进行羊水细胞染色体核型分析及FISH检测，以进一步确诊是否孕育染色体异常的胎儿。虽然羊水细胞染色体核型分析是产前诊断的金标准，但细胞培养周期较长，大约需要5～7 d，加之后续的一系列操作，一般要2～3周才可报告结果，并且操作过程中对操作人员的技术要求和操作环境的无菌要求都较高，稍有不慎，都会造成标本的污染。相比于传统的羊水细胞染色体核型分析而言，FISH检测具有诊断快速、结果直观等优势，一般24 h甚至更短时间便可报告结果，且可靠性达到99.8%以上，大大缩短了孕妇等待结果的时间，减轻了孕妇的心理压力。

羊水细胞染色体核型分析和FISH检测都属于侵入性实验，在对孕妇进行羊膜腔穿刺抽取羊水的过程中存在一定的风险。据报道，羊水穿刺会使流产的风险率提高0.5%～1%[9]，并且绝大多数高危孕妇羊水细胞染色体核型分析结果正常[10]。因此，探寻一种操作安全且结果准确的无创产前检测技术已成为必然。

1997年，Lo等[11]研究发现在孕妇的血浆中存在胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cff-DNA)，这一重大发现为无创产前检测技术的研究开辟了新的领域。伴随着新一代高通量测序技术的迅猛发展，无创DNA产前检测技术应运而生。无创DNA产前检测技术是通过对孕妇外周血中胎儿游离DNA进行高通量测序，并将测序结果进行生物信息学分析，从而得出胎儿发生染色体非整倍体的风险率。该技术具有准确率高、周期短等优点，据有关文献报道，准确率可高达99%[12]。虽然现阶段该技术成本较高，尚未得到广泛应用，但随着技术的发展，检测成本的下降，这一技术必将为大众所接受，从而最大限度地减少侵入式产前诊断给孕妇带来的风险。

对孕中期妇女进行产前筛查与产前诊断，能够有效预防出生缺陷儿的出生，提高我国的出生人口素质，具有重要的临床应用价值。血清三联法筛查相比于以往的二联法，具有更高的检出率，应在临床上大力推广。

[1] 董源芬，阮详燕．唐氏综合征的产前筛查进展[J]．中国妇幼保健，2004，19(14)：120-121．

[2] 张方芳，徐永莲，张光艳，等．孕中期产前筛查/产前诊断在减少出生缺陷中的价值[J]．中国妇幼保健，2013，28(28)：4711-4713．

[3] LO YM,TEIN M SC，LAU TK,etal．Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum:implications for noninvasive prenatal diagnosis[J]．The American Journal of Human Genetics,1998,62(4):768 -775．

[4] 郭辉，卓坚臻，霍梅，等．非结合雌三醇在孕中期产前筛查中的应用价值分析[J]．国际检验医学杂志，2014,35(7)：819-821．

[5] MULLER F,FORESTIER F,DINGEON B,etal．Second trimester trisomy 21 maternal serum marker screening results of a countrywide study of 854 902 patients[J]．Prenat Diagn,2002,22:925.

[6] MALONE FD,CANICK JA,BALL RH,etal.First-trimester or second-trimester screening or both for Downs syndrome[J]．N Engl J Med,2005,303:2001.

[7] 王靖，陈汉平.母体外周血中游离胎儿核酸物质在无创性产前诊断中的研究进展[J]．中国优生与遗传杂志，2010,18(11)：3-5.

[8] 边旭明，戚庆讳.染色体异常产前蹄查和产前诊断工作任重而道远[J]．实用妇科与产科杂志，2010,26(12)：889-890.

[9] 迟洪滨，程利南，李岩，等.孕妇血浆中胎儿游离DNA检测在唐氏综合征产前诊断中的应用[J]．中华妇产科杂志，2006，41(4)：276-277.

[10]梁雄，朱峰，朱兰芳，等.3195例孕中期唐氏综合征的血清筛查和产前诊断临床分析[J]．中国现代医学杂志，2005，15(20)：3079-3084.

[11]LO YM，CORBETTA N，CHAMBERLAIN PF，etal．Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]．The lancet，1997，350(9076):485-487．

[12]刘福民.无创伤性产前诊断胎儿染色体非整倍体的研究进展[J]．中华临床医师杂志，2010，4( 5):547-551．

Analysis of the serological screening index and prenatal diagnosis findings in 8606 women in the second trimester

ZHU Xiang,XU Fang,WANG Yuping,FU Xia,LI Shuqin,LI Li,PU Chun,WU Qiwen

Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective： To assess the clinical value of prenatal diagnosis and serological screening indicators for accurate predication of trisomy 21 syndrome.Methods:Serological screening tests pertainting to α-fetoprotein(AFP),β-human chorionic gonadotrophin(β-HCG) and free estriol(uE3) were performed with time-resolved fluorescence immunoassay in 8606 women during thier second trimester.The risk values were estimated with the risk assessment software for prenatal screening data based on women in south China by consideration of risk factors associated with age,pregnant weeks and body weight of pregmant women.Karyotype analysis for amniotic fluid and fluorescence in situ hybridization were offered to the women at high risks,and telephone interview was done to the women at low risks and those at high risks refusing prenatal diagnosis.Results:①Screened positive rates for Down′s syndrome(DS),Edward′s syndrome(ES) and opening neural tube defects(ONTD) were 6.47%(557/8606),0.17%(15/8606) and 0.56%(48/8606) in teh 8 606 women;② Prenatal diagnosis by amniotic cell culturing revealed DS in 8 cases and ES in 2.Besides,chromosome karyotype determination of the amniotic cells revealed Turner syndrome in 3 cases,Klinefelter syndrome in 1 and chromosomal abnormalities in 2;③ Telephone interview showed that serological indicators had screened 84.62% of DS in prenatal diagnosis,though false positive rate(6.34%) and false negative rate(0.02%) occurred.Conclusion： Second trimester serological screening plus amniocentesis may be valuable role in prevention of common chromosome syndromes.

prenatal screening;prenatal diagnosis;Down′s syndrome;fluorescence in situ hybridization

1002-0217(2016)06-0568-04

弋矶山医院人才引进项目(YR200904)；弋矶山医院三新项目(Y1457)

2016-01-21

朱 翔(1991-),男,2014级硕士研究生,(电话)15905538529,(电子信箱)xiaozhuhanzi@163.com； 武其文,男,副主任医师,(电子信箱)yjslab@163.com，通信作者.

R 714.5

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