沈媛媛，卢毅宁，胡坤媚，胡浩然，郝 伟，杨解人

(皖南医学院 国家级中药药理三级实验室，安徽 芜湖 241002)



·基础医学·

玉夏胶囊对自发性高血压大鼠心肌损伤的保护作用

沈媛媛，卢毅宁，胡坤媚，胡浩然，郝 伟，杨解人

(皖南医学院 国家级中药药理三级实验室，安徽 芜湖 241002)

目的：观察玉夏胶囊对自发性高血压大鼠(SHR)心肌iNOS、NADPH氧化酶亚单位p22phox和p47phox表达的影响，探讨玉夏胶囊对SHR心肌损伤的保护作用机制。方法：14周龄雄性SHR 28只,随机分为SHR模型组[0.5% 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5 mL/kg]、玉夏胶囊高、中、低(0.6、0.3、0.15 g/kg)剂量组，每组7只。另设WKY(0.5% CMC-Na 5 mL/kg)正常对照组7只。各组每日灌胃1次，连续10周，于给药前和末次给药后尾袖法测定血压；比色法测定心肌组织SOD、MDA、T-AOC及H2O2的含量；硝酸还原酶法测定心肌组织NO含量；免疫组化法表达心肌诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性细胞；Western Blot表达心肌组织iNOS、p22phox及p47phox蛋白。结果：玉夏胶囊随着剂量的增加，能显著降低SHR的血压(P<0.05或P<0.01)，减少SHR心肌组织MDA、H2O2及NO的含量(P<0.05或P<0.01)，提高SOD和T-AOC的含量(P<0.05或P<0.01)，抑制心肌iNOS阳性细胞表达，下调心肌iNOS、p22phox和p47phox蛋白(P<0.05或P<0.01)。结论：玉夏胶囊具有抗SHR心肌氧化应激的作用，其机制可能与下调心肌iNOS及p22phox、p47phox所介导的氧化应激损伤有关。

玉夏胶囊；自发性高血压大鼠；氧化应激；iNOS；p22phox；p47phox

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.003

高血压是心脑血管疾病主要的危险因素，其中高血压性心脏病是高血压最常见并发症[1]。近年来研究表明，高血压心脏病进程中常伴有氧化应激(oxidative stress)，后者在高血压的病程发展中起着重要作用[2]。研究表明高血压病理状态下一氧化氮合酶(iNOS)和NADPH氧化酶这两种酶的表达和活性都被不同程度的诱导增强，导致机体氧化应激损伤[3-5]。玉夏胶囊主要成分含夏枯草、玉米须、莱菔子及防己等。文献报道，玉夏胶囊对不同证型的高血压病患者均有显著的降压效果[6-8]。动物实验发现玉夏胶囊对肾性高血压大鼠具有降压作用[5]。但关于玉夏胶囊对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌损伤的保护作用未见报道。故本研究选用SHR为对象，观察玉夏胶囊对SHR心肌氧化应激损伤的保护作用，并通过研究iNOS及NADPH 氧化酶亚单位p22phox、p47phox的蛋白表达来探讨其可能机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物 SPF级14周龄雄性SHR 28只，Wistar- Kyoto ( WKY) 大鼠 7 只，体质量260～320 g，许可证号：SCXK(京)2015-0001，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠单笼饲养，自然光照，自由进食(饲料购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场)饮水，室温23～25℃，相对湿度60%～65%。

1.2 药物、试剂与仪器 玉夏胶囊(安徽省芜湖市中医医院制剂室提供，0.3 g/粒)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)及BCA蛋白检测试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；即用型SABC和DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、兔抗大鼠iNOS抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、兔抗大鼠p22phox和p47phox抗体(美国Sant Cruz 公司)；小鼠抗大鼠GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(江苏碧云天生物技术研究所)；LunimataTM Crescendo 发光液(美国Millipore 公司)。ALC-NIBP无创血压测定分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)，DNM-9602型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)，Eppendorf 离心机(德国Eppendorf公司)，电泳系统、转膜系统(北京市六一仪器厂)，化学发光成像系统(美国Bio-Rad 公司)，石蜡切片机(德国Leica公司)，BX-41型奥林巴斯显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3 分组及给药 玉夏胶囊成人量1.2 g/日，按人体质量为60 kg计算，折算大鼠等效量是0.15 g/日，按2倍递增依次为0.3 g/kg、0.6 g/kg。将SHR 28只适应性喂养1周后随机分为SHR模型组(0.5% CMC-Na 5 mL/kg)，玉夏胶囊高、中、低(0.6、0.3、0.15 g/kg)剂量组，每组7只。另设WKY正常对照组(0.5% CMC-Na 5 mL/kg)7只。按上述设定剂量于每日下午3时给药，连续10周。

1.4 血压测定和标本采集 分别于给药前及末次给药后尾袖法测大鼠尾动脉舒张压(DBP/mmHg)。1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取心脏，分离左心室，取部分左心室制备10%组织匀浆，用于测定SOD、MDA、T-AOC、H2O2和NO的含量；另取部分左心室4%多聚甲醛溶液固定48 h，常规石蜡包埋，用于免疫组化测定。剩余左心室放置-80℃冰箱保存，用于Western blot。

1.5 生化指标测定 BCA法测定心肌蛋白浓度；比色法、ABTS法、二甲酚橙比色法分别检测心肌SOD、MDA、T-AOC和H2O2含量；硝酸还原酶法测定心肌NO含量。具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.6 免疫组化法表达心肌组织iNOS阳性细胞 取心肌石蜡切片(厚度5 μm/片)，常规脱蜡至水，抗原修复，封闭，iNOS一抗(1∶100)4℃过夜，二抗(1∶200)，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片，镜下观察胞质内iNOS阳性细胞表达(阳性表达呈黄至棕黄色颗粒)。大鼠染色切片在相同条件下随机选取6个区域拍摄，采用 Image-pro plus 6.0 图像分析软件半定量分析，测定平均积分光密度值 (AIOD)，AIOD越大表示iNOS表达愈高，反之则表达愈低。

1.7 Western blot 表达心肌组织iNOS、NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox蛋白 低温提取心肌蛋白。每孔上样40 μg蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离样品，转膜，封闭，分别加入GADPH (1∶1000)、 iNOS (1∶400)、p22phox(1∶200)和p47phox(1∶200)一抗4℃过夜，加入相应二抗 (1∶2000)，室温孵育2 h，加发光液，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系统进行拍摄，用Image J 1.43(National Institutes of Health)软件测定集成光密度值。

2 结果

2.1 玉夏胶囊对SHR尾动脉舒张压的影响 给药前各组大鼠舒张压明显高于WKY组(P<0.01)；给药10周后，与WKY组比，SHR组舒张压显著升高，玉夏胶囊各给药组舒张压较SHR组明显降低(P<0.01)，且玉夏胶囊高剂量组降压效果最为明显，提示玉夏胶囊具有一定的降压作用(见表1)。

组别剂量/(g/kg)血压/mmHg给药前给药10周后WKY-96±10.6797±11.20SHR-151±11.15**175±13.05**+玉夏0.6152±12.56**126±14.49##+玉夏0.3156±9.20**134±15.98##+玉夏0.15153±15.17**148±14.67##F值31.9929.57P值0.000.00

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR。

2.2 玉夏胶囊对SHR心肌组织SOD、MDA、T-AOC和H2O2含量的影响 与WKY组比，SHR组心肌组织匀浆MDA和H2O2含量显著升高(P<0.01)，SOD和T-AOC含量明显降低(P<0.01)；与SHR组比，玉夏胶囊各剂量组MDA和H2O2含量明显下降(P<0.05或P<0.01)，SOD和T-AOC含量显著升高(P<0.05或P<0.01)，提示玉夏胶囊具有一定的抗氧化作用(见图1)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR；FSOD=20.99，FMDA=24.11，FT-AOC=45.84，FH2O2=68.40。

2.3 玉夏胶囊对SHR心肌组织NO含量的影响 与WKY组比，SHR组心肌组织NO含量明显上升(P<0.01)；与SHR组比，玉夏胶囊各剂量组均有不同程度的下降(P<0.01)，提示玉夏胶囊可以降低SHR心肌NO含量(见图2)。

2.4 玉夏胶囊对SHR心肌iNOS阳性细胞表达的影响 免疫组化结果显示，SHR组心肌iNOS阳性细胞表达显著高于WKY组(P<0.01)；与SHR组比，玉夏胶囊各剂量组随着剂量增加心肌iNOS阳性细胞的表达显著降低(P<0.01)，提示玉夏胶囊能降低SHR心肌iNOS阳性细胞的表达(见图3)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR，F=48.23。

图2 玉夏胶囊对SHR心肌组织NO含量的影响

图3 玉夏胶囊对SHR心肌 iNOS阳性细胞表达的影响

A：WKY组；B：SHR组；C：玉夏0.6 g/kg组；D：玉夏0.3 g/kg组；E：玉夏0.15 g/kg组；*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P<0.01vs. SHR。

2.5 玉夏胶囊对SHR心肌iNOS蛋白表达的影响 Western blot检测发现，SHR组心肌iNOS蛋白的表达水平显著高于WKY组(P<0.01)；与SHR组比，玉夏胶囊高、中剂量组能显著下调SHR心肌iNOS蛋白的表达(P<0.01)，提示玉夏胶囊可下调SHR心肌iNOS蛋白表达(见图4)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR。

图4 玉夏胶囊对SHR心肌iNOS蛋白表达的影响

2.6 玉夏胶囊对SHR心肌p22phox和p47phox蛋白表达的影响 与WKY组比，SHR组心肌p22phox和p47phox蛋白表达明显上调(P<0.01)；与SHR组比，玉夏胶囊各剂量组p22phox和p47phox蛋白表达均有不同程度的下调(P<0.05或P<0.01)，提示玉夏胶囊具有下调SHR心肌p22phox和p47phox蛋白的作用(见图5)。

*P< 0.05，**P< 0.01vs. WKY;#P< 0.05，##P< 0.01vs. SHR。

3 讨论

SHR是一种与人类原发性高血压相似的遗传高血压模型。研究表明，长期高血压可导致左心室肥厚和心肌纤维化等心肌损伤[9]。文献报道，心肌损伤的各个环节都有氧化应激的参与[2]。氧化应激是活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)或自由基(O2-、H2O2和OH-)在细胞内或细胞外产生对细胞有毒性的一种应激状态[10]。MDA含量可间接反映机体脂质过氧化程度，H2O2是活性氧代谢的副产物，SOD是生物体内一种重要的抗氧化物酶，T-AOC是机体包括酶促和非酶促体系的抗氧化能力衡量指标。本研究发现26周SHR心肌氧自由基(MDA、H2O2)明显升高，而抗氧化能力(SOD、T-AOC)明显减弱，提示SHR心肌存在明显氧化应激状态。当给予玉夏胶囊治疗10周后，SHR心肌组织SOD活性和T-AOC能力明显提高，MDA和H2O2含量显著降低，说明玉夏胶囊对SHR心肌的氧化应激损伤具有一定保护作用，其保护作用可能与玉夏胶囊组方中莱菔子和防己增加大鼠心肌组织SOD活性，降低MDA含量，清除氧自由基，提高总抗氧化能力，改善氧化应激有关[11-12]。但玉夏胶囊是通过何种机制来改善SHR心肌氧化应激损伤？为此本研究从iNOS-NO通路及NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox途径，探讨玉夏胶囊抗SHR心肌氧化应激损伤的可能机制。

心肌细胞内主要存在iNOS。生理状态下心肌细胞内iNOS含量极少，病理状态下在细胞因子(如TGF-β1、TNF-α)等刺激后，可诱导ROS聚集，心肌细胞内iNOS表达增加，产生大量NO[3]。NO是参与体内信号传导的气体信号分子，与超氧离子(O2-)反应生成亚硝基，造成氧化应激损伤[13-14]。故本实验采用硝酸还原酶法测定心肌NO含量，免疫组化法和Western Blot法分别检测心肌组织iNOS阳性细胞和蛋白。结果发现SHR心肌组织中NO含量增高，iNOS阳性细胞和蛋白表达明显上调，说明SHR心肌iNOS蛋白大量表达，过量NO产生，从而引起心肌氧化应激损伤。通过玉夏胶囊治疗10周后，SHR心肌组织内NO的含量明显下降，iNOS阳性细胞和蛋白表达明显下调，提示玉夏胶囊减少NO产生，下调iNOS蛋白表达，改善SHR心肌氧化应激损伤。

NADPH氧化酶存在于吞噬细胞以及非吞噬细胞，主要有位于胞膜的p22phox和gp91phox以及胞质中的p47phox、p67phox等亚单位,是心血管组织中ROS的主要来源[14]。NADPH氧化酶过度激活，促使ROS大量生成，导致氧化应激损伤，参与高血压及其并发症的形成[4-5]。本研究发现SHR心肌p22phox、p47phox蛋白表达均升高，给予玉夏胶囊治疗后，SHR心肌p22phox、p47phox蛋白表达显著下降，说明玉夏胶囊通过下调心肌NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox通路，改善心肌氧化应激损伤。

综上所述，玉夏胶囊对SHR心肌氧化应激损伤具有保护作用，其机制可能通过降低心肌自由基含量，提高抗氧化能力，抑制心肌iNOS-NO以及 NADPH氧化酶亚基p22phox和p47phox所介导的通路密切相关，确切机制有待于进一步研究。

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Protective effect of Yuxia capsule on myocardium injury in spontaneously hypertensive rats

SHEN Yuanyuan,LU Yining,HU Kunmei,HU Haoran,HAO Wei,YANG Jieren

National Grade Three Laboratory for Traditional Chinese Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To investigate the mechanisms of Yuxia capsule in protecting the myocardium injury in spontaneously hypertensive rats(SHR) through observing the effect of this agent on the expression of iNOS,NADPH oxidase subunits p22phoxand p47phox.Methods:Twenty-eight male SHRs,aged 14-week,were randomized into SHR model group (0.5% CMC-Na,5 mL/kg)，high dosage group( Yuxia capsule,0.6 g/kg),middle dosage group(0.3 g/kg) and low dosage group(0.15 g/kg)(n=7 for each group).Another 7 Wistar-kyoto( WKY) rats were included as normal control group (0.5% CMC-Na,5 mL/kg).Rats in each group intragastrically administrated with Yuxia capsule once a day for consecutive 10 weeks,measured for the blood pressure by tail cuff before and final administration.The changes of rat myocardium MDA,H2O2,SOD,T-AOC and NO levels in myocardium homogenate and expression of myocardium iNOS positive cells were determined by immunohistochemistry and the expression of iNOS,p22phoxand p47phoxprotein was detected by Western blotting.Results:Increased dose of Yuxia capsule had significantly decreased the blood pressure (P<0.05 orP<0.01) and reduced the levels of MDA,H2O2and NO,yet enhanced the levels of SOD and T-AOC in myocardium (P<0.05 orP<0.01) as well as inhibited expression of iNOS,p22phoxand p47phoxprotein and iNOS positive cells in the myocardium (P<0.05 orP<0.01).Conclusion:Yuxia capsule could decrease the expression of iNOS,p22phoxand p47phoxprotein to reduce oxidative stress at myocardium in SHR,suggesting that this agent has protective effect on myocardium damage in SHRs.

Yuxia capsule；spontaneously hypertensive rats；oxidative stress；iNOS；p22phox；p47phox

1002-0217(2016)06-0519-05

2016-05-30

沈媛媛(1989-)，女，2014级硕士研究生，(电话)18255363538，(电子信箱)471007201@qq.com； 杨解人，女，教授，硕士生导师，(电子信箱)jryang1955@sina.com，通信作者.

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