张明慧，孙靖涵，CHOUMI TCHAMBA Alida，赵莹，于洋，张琳，于波

（1.中国医科大学附属第一医院心内科，沈阳 110001；2.辽阳市第二人民医院心内科，辽宁 辽阳 111000）

乙醇通过干预PGC⁃1α表达水平调节AC16心肌细胞线粒体生成

张明慧1，孙靖涵1，CHOUMI TCHAMBA Alida1，赵莹2，于洋1，张琳1，于波1

（1.中国医科大学附属第一医院心内科，沈阳 110001；2.辽阳市第二人民医院心内科，辽宁 辽阳 111000）

目的探究不同浓度乙醇干预下AC16心肌细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC⁃1α）及其下游蛋白核呼吸因子1（NRF⁃1）、线粒体转录因子A（TFAM）表达水平的变化以及心肌细胞线粒体结构功能的改变。方法应用MTT法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞线粒体膜电位改变，电镜下观察细胞超微结构改变，应用实时定量PCR、Western blotting技术分别在基因及蛋白水平检测细胞PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM表达水平的变化。结果低浓度乙醇组（50 mmol/L）线粒体数量增加，线粒体膜电位升高，PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM表达上调；高浓度乙醇组（200 mmol/L）线粒体数量减少、畸变，线粒体膜电位下降，PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM表达下调。结论乙醇对心血管疾病的影响主要是通过调节心肌细胞中PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM表达水平从而影响心肌细胞线粒体生成实现的。

乙醇；过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α；核呼吸因子1；线粒体转录因子A；AC16心肌细胞；线粒体生成

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过量饮酒可导致酒精性心肌病、脑血管疾病、肝硬化、糖尿病等多种疾病的发生，然而也有大量研究表明，适量规律的饮酒对人们的健康大有裨益，可降低心血管疾病的发病率及死亡率，乙醇的摄入量与心血管病的发生呈J型曲线关系［1］。可见乙醇是一把双刃剑，如何运用好这把利剑为我们的健康保驾护航至关重要，其分子学机制有待探究。

心脏作为高耗能器官对能量供应的改变较为敏感，大量研究证明多种心血管疾病均存在能量代谢紊乱，其中包括缺血性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心衰等［2-4］。线粒体是心肌细胞能量代谢相关的重要细胞器，占心肌细胞体积的60%，是氧化糖类、脂类及氨基酸产生ATP为细胞提供能量的重要场所。在酒精性心肌病患者及动物模型中均发现心肌细胞线粒体结构异常，主要表现为线粒体数量明显减少，结构肿大，线粒体嵴结构紊乱，且有的线粒体嵴结构消失呈空泡样变等异常改变［5-6］。由此，我们推想乙醇对心血管疾病的影响可能与其对心肌细胞内线粒体生成的影响有关。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferators⁃activated receptor⁃γ coactivator⁃1 α，PGC⁃1α）是调节线粒体生成的关键因子，且有实验证实乙醇可通过影响PGC⁃1α表达对神经细胞线粒体生成进行调节［7］，由此本研究检测了不同浓度乙醇下人源心肌细胞系（AC16细胞）PGC⁃1α及其下游蛋白核呼吸因子1（respiratory factor⁃1，NRF⁃1）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）表达的变化，探究乙醇摄入与心血管疾病发病关系的分子机制。

1　材料与方法

1.1材料

AC16细胞购自广州莱德尔公司；胎牛血清购自澳大利亚Excell公司；高糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司；MTT试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自中国碧云天公司；RNA提取试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；基因引物购自中国生工生物工程股份有限公司；抗PGC⁃1α兔多克隆抗体购自美国Abcam公司；抗NRF⁃1兔多克隆抗体、抗TFAM兔多克隆抗体、抗GAPDH兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体购自北京博奥森公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理：应用含有10%胎牛血清、青链霉素的高糖DMEM培养基，5%CO2、37℃下培养AC16心肌细胞24 h；待细胞生长至培养瓶面积的60%左右时，分别应用含不同浓度乙醇（0、50、100、200 mmol/L）的培养基培养24 h后收取细胞用于后续实验。

1.2.2MTT法检测细胞存活率：将对数生长期细胞接种于96孔板，约5×103/孔，5%CO2、37℃下培养24 h，每孔中细胞生长至60%左右，分别加入含0、100、200、300、400及500 mmol/L乙醇的培养基培养，继续培养24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 15 μL，继续孵育4 h后，弃培养基，加入二甲基亚砜（150 μL/孔），置摇床上摇晃10 min。酶标仪测490 nm吸光值，计算细胞的存活率。制作浓度生存率曲线。

1.2.3实验分组：根据MTT法所得结果将200 mmol/L设为高浓度乙醇组，依次设低浓度乙醇组（50mmol/L）、中浓度乙醇组（100 mmol/L），正常对照组为不含乙醇的DMEM培养培养基。

1.2.4电镜下观察对照组及乙醇组细胞超微结构改变：将细胞接种于75 cm2培养瓶中培养24 h，分别加入含0、200 mmol/L乙醇的培养基继续培养24 h，胰酶消化细胞，2 000 r/min 4℃离心10 min，收取细胞，细胞体积2 mm3左右。戊二醛中固定24 h，锇酸固定2 h。梯度乙醇脱水，用浸泡液（环氧树脂混液∶纯丙酮=1∶1）37℃中浸泡24 h；包埋切片，应用醋酸铀、硝酸铅双重电子染色，透射电镜观察样本。

1.2.5流式细胞术测定线粒体膜电位：细胞接种于6孔板培养24 h；分别加入含0、50、200 mmol/L乙醇的培养基继续培养24 h，用PBS洗涤细胞2次，用胰酶收集细胞，应用含有1 mL细胞培养液和1 mL JC⁃1染色工作液重悬细胞并孵育20 min，流式细胞仪检测线粒体膜电位。

1.2.6实时定量PCR：应用Trizol一步法提取心肌细胞总RNA；取总RNA 1 μg，在20 μL逆转录体系中合成cDNA；将2 μL上述所得cDNA及靶基因上下游引物加入25 μL体系中进行PCR扩增。引物序列如下，PGC⁃1α上游引物5’⁃CCTGCATGAGTGTGTG CTCT⁃3’，下游引物5’⁃CAGCACACTCGATGTCACT CC⁃3’；NRF⁃1上游引物5’⁃TCCTGGTCCAGAACTT TACACA⁃3’，下游引物5’⁃TGAAGTTCTACAAGTTT TGTCCTGT⁃3’；TFAM上游引物5’⁃CTTCACCTTGG TCTCGGTGT⁃3’，下游引物5’⁃AGGAGCAGAGCCA CAGTCAT⁃3’；GAPDH上游引物5’⁃GTACGACTCA CTATAGGGA⁃3’，下游引物5’⁃AGGTGACACTATA GAATA⁃3’。

1.2.7Western blotting：应用蛋白裂解液RIPA及PMSF冰上提取蛋白，以BSA为标准对上清进行蛋白定量。应用SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲液制备蛋白样本，将20 μg蛋白样品加入到SDS⁃PAGE胶加样孔中，浓缩胶80 V，分离胶100 V，电泳；冰浴100 V转膜90 min。置于5%BSA封闭液中室温封闭2 h。一抗4℃过夜，一抗体浓度分别为PGC⁃1α 1∶1 000，NRF⁃1 1∶500，TFAM 1∶500。二抗摇床上室温孵育1 h，二抗稀释浓度1∶10 000。ECL曝光显色，用图像分析系统进行分析。

1.3统计学分析

2　结果

2.1不同浓度乙醇对AC16细胞存活率影响

应用MTT法测定不同浓度乙醇（0、100、200、200、400、500 mmol/L）对AC16细胞存活率影响，选择适宜的乙醇浓度用于后续实验。如图1所示，＜200 mmol/L的乙醇对细胞存活率无明显影响，当乙醇浓度达到300 mmol/L时细胞存活率下降至（79.7± 3.0）%（P＜0.05），500 mmol/L时细胞存活率下降至（48.9±2.0）%。因此本研究中应用200 mmol/L浓度乙醇作为最高浓度，依次设100 mmol/L为中浓度乙醇组，50 mmol/L为低浓度乙醇组，正常对照组无乙醇。

2.2不同浓度乙醇对AC16细胞超微结构影响

图1　不同浓度乙醇对AC16细胞存活率的影响Fig.1　Effect of different concentrations of ethanol on cell viabili⁃ty of AC16 cardiomyocytes

不同浓度乙醇下心肌细胞超微结构改变有明显差异，对照组（图2A）AC16细胞内可见大量线粒体，呈椭圆形，线粒体嵴结构整齐；低浓度乙醇组（图2B）可见线粒体数量有所增加，结构未见明细异常；高浓度乙醇浓度组（图2C、2D）可见细胞内线粒体数量明显减少，线粒体增大，线粒体嵴结构紊乱，时有线粒体嵴结构消失呈空泡样改变。

图2　不同乙醇浓度对AC16心肌细胞超微结构影响Fig.2　Effects of different concentrations of ethanol on ultrastructure of AC16 cardiomyocytes

2.3不同浓度乙醇对AC16细胞线粒体膜电位影响JC⁃1是一种用于检测线粒体膜电位荧光探针。线粒体膜电位升高，JC⁃1跨膜以聚合物的形式存在于线粒体基质中，可以产生红色荧光；线粒体膜电位减低，JC⁃1以单体形式存在于细胞基质中，可以产生绿色荧光。线粒体膜电位的检测可通过红绿荧光的相对比率来衡量。流式细胞术检测正常对照组红绿荧光比率为7.45±0.41，低浓度乙醇组为9.18±0.54，高浓度乙醇组为4.40±0.62。与正常对照组相比，低浓度乙醇组红绿荧光比率升高（P＜0.05），而高浓度乙醇组明显下降（P＜0.05）。低浓度乙醇组与正常对照组比较，线粒体膜电位升高（37.3±1.4）%（P＜0.05）；高浓度乙醇组与正常对照组比较，线粒体膜电位下降（31.9±2.1）%（P＜0.05）。见图3。

2.4不同浓度乙醇对AC16细胞PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAMmRNA表达水平影响

应用实时定量PCR检测不同乙醇浓度下PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAMmRNA表达水平改变，探索乙醇影响心肌糖脂代谢及线粒体生成的细胞内信号通路。与正常对照组比较，低浓度乙醇组AC16细胞PGC⁃1αmRNA表达增加（84.2±5.9）%（n=3，P＜0.05），而高浓度乙醇组PGC⁃1αmRNA表达下降（52.2±9.9）%（n=3，P＜0.05）。PCG⁃1α的下游基因NRF⁃1和TFAMmRNA表达也呈相同趋势的改变。见图4。

图3　不同乙醇浓度对AC16细胞线粒体膜电位影响Fig.3　Effect of different concentrations of ethanol on of mitochondrial membrane potential in AC16 cardiomyocytes

图4 不同乙醇浓度下AC16细胞PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM mRNA表达水平Fig.4　Expressions of PGC⁃1α，NRF⁃1，and TFAM mRNA under different concentrations of ethanol in AC16 cardiomyocytes

2.5不同浓度乙醇对AC16细胞PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM蛋白表达水平影响

不同浓度乙醇下PGC⁃1α蛋白表达情况与mRNA表达变化趋势一致。低浓度乙醇组PGC⁃1α蛋白表达增加（49.4±4.8）%（n=3，P＜0.05），而高浓度乙醇组PGC⁃1α蛋白减少（47.2±2.7）%（n=3，P＜0.05）。PGC⁃1α调控的下游蛋白NRF⁃1和TFAM表达也呈一致的表达趋势。见图5。

3　讨论

大量临床研究［8-9］证实长期大量饮酒可导致酒精性心肌病，表现为心室扩大、心律失常、心肌收缩力减弱，最终发展为心力衰竭；然而，也有研究［10-11］证明适量饮酒可降低脑卒中、心肌梗死等心血管疾病的发病率及死亡率，尤其饮酒量与冠心病的发生呈J型曲线关系，但相关机制并不明确。

大量研究表明线粒体功能障碍是多种疾病的病理基础，包括动脉粥样硬化［5］、神经肌肉功能障碍［6］、肝硬化［12］、肌无力［13］等多种疾病。心肌作为高能量代谢组织，对线粒体功能改变更为敏感，心血管疾病、缺血性心肌病、心衰及多种继发或原发性心肌病均存在线粒体功能障碍［14］，在酒精性心肌病患者及动物模型中均发现心肌细胞线粒体结构及功能异常［15-16］，表明乙醇对心血管病发病的影响可能与其对线粒体生成的影响相关。

本研究中应用不同浓度乙醇培养AC16心肌细胞，发现低浓度乙醇干预下细胞内线粒体数量增多，结构未见明显异常；而高浓度乙醇干预下细胞内线粒体数量减少，体积增大，嵴结构紊乱，有的嵴结构消失呈囊泡样改变，与酒精性心肌病患者及动物模型中发现的线粒体结构改变存在一定共性。

图5　不同乙醇浓度下AC16细胞PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM蛋白表达水平Fig.5　Expressions of PGC⁃1α，NRF⁃1，and TFAM protein under different concentrations of ethanol in AC16 cardiomyocytes

线粒体膜电位在不同浓度乙醇刺激下也发生相应改变，在低浓度乙醇组一定程度升高，而在高浓度乙醇组下降。线粒体结构及功能异常同时伴有其调控蛋白表达水平的改变，研究发现高浓度乙醇干预下PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM表达下调，而低浓度乙醇可增强三者表达，三者对线粒体结构及功能的调控具有重要作用，乙醇可通过调节PGC⁃1α、NRF⁃1、TFAM表达，对心肌细胞线粒体生成产生双向影响，从而影响心血管疾病的发生发展。

PGC⁃1α是调节细胞及机体能量代谢的关键因子，是线粒体生成重要的转录激活因子［17］，在维持心肌细胞能力供应方面发挥重要作用。在许多培养细胞中异位过表达PGC⁃1α可以诱导呼吸链亚基蛋白mRNA水平升高，细胞色素C、COX1⁃5、ATP合成酶表达增强，线粒体呼吸功能得以提高［18］。有研究［17］证明PGC⁃1α主要通过诱导NRF⁃1的表达来调节线粒体生成，抑制NRF⁃1表达可以阻断PGC⁃1α提高线粒体生成作用。NRF⁃1是调控线粒体呼吸功能的重要因子，在整合核基因与线粒体DNA（mito⁃chondrial DNA，mtDNA）表达的协调性上同样发挥重要作用，此外NRF⁃1也可提高TFAM表达。mtDNA可转录多种线粒体呼吸功能相关因子及线粒体功能蛋白，TFAM是mtDNA复制转录的直接调控子［12］，在TFAM基因敲除鼠中发现mtDNA复制明显减少及心肌线粒体电子传递能力遭到破坏［2］，在小鼠心衰模型中发现mtDNA结构异常及修复障碍，TFAM过表达可改善线粒体功能，调节线粒体的转录机制，改善心肌重构及纤维化［19］。异位表达的PGC⁃1α可使NRF⁃1mRNA表达增强2倍，TFAM启动子活性增强4倍［18］。在许多动物心衰模型中发现PGC⁃1α表达水平下降，进一步证明了PGC⁃1α与心功能的改变具有一定关联性。

综上所述，乙醇主要通过调节心肌细胞中PGC⁃1α表达水平，对心肌细胞线粒体生成进行调节，在一定程度上解释了乙醇摄入量与心血管疾病患病率J型曲线关系。这对人们日常生活有一定指导意义，同时为心血管病的防治提供药物治疗新靶点。

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（编辑陈姜）

Ethanol Modulates Mitochondrial Production of AC16 Cardiomyocytes by Interfering with PGC⁃1α Expression

ZHANG Minghui1，SUN Jinghan1，CHOUMI TCHAMBA Alida1，ZHAO Ying2，YU Yang1，ZHANG Lin1，YU Bo1
（1.Department of Cardiology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Cardiology，The Second People’s Hospital of Liaoyang City，Liaoyang 111000，China）

ObjectiveTo investigate the expression of peroxisome proliferator⁃activated receptor γ coactivator⁃1α（PGC⁃1α），nuclear respiratory factor 1（NRF⁃1），mitochondrial transcription factor A（TFAM）and mitochondrial structural and functional alterations under different concentra⁃tions of ethanol.MethodsMTT assay was used to determine the survival rate of AC16 cells under different concentrations of ethanol，and the ap⁃propriate concentration of ethanol used for subsequent experiments was selected.Mitochondrial membrane potential of AC16 cells was measured by flow cytometry using fluorescent probe JC⁃1.The ultrastructural changes of different groups of cells was observed under the electron microscope. The expressions of PGC⁃1α and its target proteins NRF⁃1 and TFAM were detected by real⁃time PCR and Western blotting.ResultsThe number of mitochondrion，mitochondrial membrane potential，and the expressions of PGC⁃1α，NRF⁃1，and TFAM were increased in low⁃concentration eth⁃anol group（50 mmol/L）.While in high⁃concentration ethanol group（200 mmol/L），they were all decreased，some mitochondria were larger than normal size；the cristae in some mitochondria were disordered，and some mitochondria had no cristae，appearing as circular or elongated vesicles. ConclusionThe effect of ethanol on cardiovascular disease is mainly by regulating the expressions of PGC⁃1α and its downstream proteins NRF⁃1 and TFAM，which are the key factors in regulating mitochondrial biogenesis.

ethanol；peroxisome proliferator⁃activated receptor γ coactivator⁃1α；nuclear respiratory factor 1；mitochondrial transcrip⁃tion factor A；AC16 cardiomyocyte；mitochondrial biogenesis

R514.8

A

0258-4646（2016）12-1094-06

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.009

辽宁省科学技术计划（2012225084）；沈阳市科技计划（F12⁃193⁃9⁃03，F16⁃206⁃9⁃08）

张明慧（1989-），女，医师，硕士.

于波，E-mail：ybdyybdy@163.com

2016-05-16

网络出版时间：