刘翠娴 熊符

一、引言

出生缺陷可造成胎儿、婴儿的死亡，人类寿命的缩短，并可导致许多儿童患病和残疾，因此成为当今各国重视的卫生问题。相当一部分出生缺陷是基因及染色体变异导致，而基因组拷贝数变异就是其中之一［1－2］。基因组拷贝数变异 (copy number variations，CNVs)即染色体片段的重复或缺失，指与已报道的正常基因组相比，拷贝数存在差异且增加或减少的碱基数目＞1kb，这是一种十分普遍的染色体变异，并且很多染色体数目的变异都与疾病直接相关［3］。为减少及预防缺陷婴儿的出生，精准的产前诊断技术及专业的遗传咨询必不可少。目前，主要的产前诊断技术包括核型分析、染色体微阵列分析、荧光原位杂交技术 (fluorescence in situ hybridization，FISH)、多重连接探针扩增技术、荧光定量PCR、聚合酶链式反应及Sanger测序、高通量测序等。其中，染色体微阵列分析是2001年人类基因组计划完成后衍生的一种新的分子水平染色体分析技术，在进行全基因组扫描时，其高分辨率能够检出＜50kb的基因拷贝数变异。CMA技术主要结合了传统的比较基因组杂交与基因探针两种方法，其基本原理是将待测基因组DNA用特定的荧光或生物素进行标记，然后结合到已包埋在固相载体上的探针阵列中，再通过检测待测基因与探针的杂交信号以实现对海量的基因信息的定量分析，该技术以PCR和分子杂交为基础，实现对靶基因的快速、有效地检测，这样不仅显著提高了检测结果的准确度，还大大提高了检测效率［4］。目前，CMA根据芯片所使用探针类型的不同分为两大类，分别是微阵列比较基因组杂交 (array-based comparative genomic hybridization，aCGH)及单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide ploymophism array，SNP array)技术［5－7］。前者探针来源于基因组寡核苷酸序列，其优势在于检测拷贝数变异方面，该技术的探针能覆盖全基因组位点，分辨率可精确到50 bp或以下;而后者是根据人类基因组单核苷酸多态性位点设计探针位点，优势在于除了能够检出CNV以外，还能够检测出大多数的单亲二倍体以及检测到低水平的嵌合体［8－10］及单基因疾病等，有利于大量样本关联连锁研究，但不能识别基因组拷贝数变异［11］。

二、CMA技术的优势

在产前诊断的过程中，对于常规产前检查、唐氏筛查、超声检查等发现的可疑征象，往往需要进行细胞和分子层面的更为准确精细的检测。临床上常用的手段有细胞培养染色体核型分析、FISH、比较基因组杂交 (comparative genomic hybridization，CGH)等。通过G显带染色体核型分析技术可以检出的基因组拷贝数变化主要表现形式为较大片段的染色体结构变异如缺失或重复或易位或倒位，对片段较小的拷贝数变异则存在漏检。针对染色体的拷贝数变异，近年来多项研究表明CMA技术能对其进行精准检测。CMA技术分辨率高，可检测出低于50kb的微缺失及微重复，且有效地克服或弥补了现有的染色体检测技术的局限性，将染色体的诊断提高到了亚显微甚至是基因的水平上，极大地提高了染色体异常的检出率，而且其具有特异性高、灵敏度强、操作简单快速等优势，已被广泛应用于微生物、肿瘤、遗传性疾病及产前诊断等多个领域［12－13］。

CMA作为一种新的检测技术，相对于传统的检测方法有不可比拟的优点［14］。传统的G显带染色体核型分析是产前细胞遗传诊断的“金标准”，其优点是可以检测到染色体的平衡异位，该技术需要培养足够量的细胞才能进行人工镜检，而且只能分辨大于10Mb的染色体变异，存在较高的人为偏差。而FISH作为针对核型分析缺陷而发展的一项更为精细的技术，具有比核型分析更高的分辨率并且可以检测到平衡及不平衡易位以及融合基因，但其一次只能检测一到数个异常染色体片段，而且不能检测杂合子缺失 (loss of heterozygosity，LOH)/单亲二倍体 (uniparental disomy，UPD)。而且，FISH的检测依赖探针，目前所制备的探针类型及数目比较单一，不能作为全基因筛查的一种方法。相较于G显带及FISH检测方法，CMA分辨率高，能够全基因组范围内检测到细微的缺失及重复;同时，SNP array利用高密度的单核苷酸芯片检测基因组基因的多态性，可以进行 LOH、UPD 以及多倍体的检测等［15－17］。而且，CMA的检测无需进行羊水细胞培养，整个实验周期只需两天，可缩短患者的心理焦虑时间，而且实验的流程经标准化处理，其结果运用软件分析，代替了以往的主观判断，降低了人为偏差［18－19］。但是，CMA也存在一定的缺点，例如不能检测平衡异位、倒位。更为重要的是，CMA目前最大问题是对结果的正确解读，其原因在于该技术能找出约1%的不确定性的拷贝数变异，这会给遗传咨询带来一定的困扰［20－21］。即使CMA存在上述一些缺点，但其对拷贝数变异检测具有显著优势，其临床应用价值不可低估。

随着科学的进步，产前筛查技术也是日新月异。近几年发展比较快的无创产前诊断即孕妇外周血高通量测序就是其中之一，其特点是对胎儿没有创伤，并且敏感性及特异性高，适合胎儿染色体非整倍体筛查［22－23］。高通量测序即深度测序，是在人类基因组测序顺利完成的基础上发展起来的第二代测序技术，该技术能较好地检测到13、18、21号染色体的整体变化情况，但对于更细微的基因组拷贝数变异，则需要提高测序的深度才能检测成功，该技术对生物信息分析要求比较高，要处理大量的测序数据。而且，无创产前高通量测序在染色体非整倍体检测中会出现假阳性及假阴性结果，可能原因包括母体细胞嵌合、母体的癌细胞、消失的双胎以及母体的拷贝数变异、游离在母体外周血的胎儿遗传片段少等。所以，无创产前高通量测序结果阳性的孕妇都需要进一步做有创的CMA或核型检测，结合CMA或核型结果对孕妇胎儿情况进行判断。同时，CMA技术在嵌合体检测方面亦优于高通量测序技术，其能根据样本DNA与探针杂交信号的比对，甚至可以精确地检测到嵌合比例。并且，高通量测序也存在不能检测染色体平衡异位、费用高、检测出的数据量大，难以分析等特点［24］。更重要的是，无创高通量测序的假阳性结果风险将会在极大程度上导致孕妇做出终止妊娠的错误决定。所以，无创产前高通量技术亦离不开CMA技术，前者做筛查，后者做验证，才能得出一个准确的产前诊断结果。

三、CMA技术在产前诊断的临床应用

CMA作为一线技术早已应用于临床，2010年国际细胞遗传学协会认定CMA为发育障碍或先天畸形患者的染色体突变检测的首选临床诊断检测技术［25］。此外，2009年美国医学遗传学学会亦推荐aCGH作为一线技术应用于智力障碍、自闭症和先天性异常患者的染色体检测［26］。美国妇产科学大会则认为对全部妊娠妇女提供有创取样微芯片检测是合适的，推荐无论风险如何，所有的孕妇都应有机会选择有创的产前诊断芯片技术检测技术［27］。2009年美国妇产科学医师协会提出建议对于超声检查证实胎儿携带一个或者多个结构异常并正在接受侵入性产前诊断的患者，建议进行CMA代替传统的胎儿核型分析检测，而且若胎儿出现宫内死亡或死产的情况，需要进一步进行细胞遗传学分析时，建议对胎儿组织 (即羊水，胎盘或妊娠物)进行染色体微阵列分析，因为该技术可以增加获得结果的可能性，提高致病畸形的检测率［28］。此外，2010年加拿大医学遗传学学会同样推荐CMA作为研究发育迟缓/精神发育迟滞、自闭症、多种先天性异常或畸形等患者的第一线实验室检测技术;当超声或胎儿磁共振成像技术检测胎儿存在结构异常，或当进行非整倍体快速扫描的结果是阴性时，建议aCGH可以代替染色体核型分析，作为一个适当的诊断检查［29］。鉴于CMA技术在医疗领域得到的高度评价，接下来简要地介绍CMA技术在产前诊断中的临床应用。

1．多发性自然流产的原因排查:2012年，Wapner等［27］人曾对3 822例核型正常的样本进行检测，发现96例 (2.5%)存在或可能存在致病的染色体拷贝数变化。而有研究显示，核型分析正常的群体中依然能检测出6%的染色体异常，而这部分人发生流产的风险更高。而5%的流产原因已经明确是由于染色体的微缺失、微重复导致，而这种畸变无法被传统检测方法所识别。2013年有研究对一例多发性流产患者进行染色体核型分析，利用SNP array确定了该患者外周血所有有核细胞的染色体核型均为47，XX，+8，找到造成患者习惯性流产的原因［30］。

2．产前胎儿染色体检测:由于染色体变异能导致多种遗传性疾病的发生，所以，应用CMA技术进行胎儿产前诊断尤为必要。该技术的产前诊断适应证包括:分娩时年龄达到或超过35岁的孕妇;孕期超声检查发现胎儿结构异常或软骨指标阳性的孕妇;曾生育过染色体异常患儿的孕妇;夫妇之一是染色体平衡异位、罗氏异位、倒位携带者的夫妇;可能携带某种X连锁遗传病基因的孕妇;曾有不明原因的自然流产史、不明原因胎儿停止发育、死产的孕妇;或新生儿死亡的孕妇等;妊娠期接触了致癌物质的孕妇;宫内发育迟缓的胎儿及其父母。其中，对超声结果显示结构异常而传统核型分析结果正常的胎儿，进行CMA技术检测尤为必要。利用CMA技术进行以上适应证的产前诊断，可以为患者提供有效的遗传咨询所需要的信息，更好地控制出生人口的身体素质。

3．胚胎植入前遗传学诊断:2006年，Le Caignec等［31］证实了aCGH应用于染色体平衡易位携带者进行第三代试管婴儿即植入前遗传学诊断 (preimplantation genetic diagnosis，PGD) 的 可 行 性。Fiorentino等［32－33］也进一步地利用aCGH技术检测了18种不同易位产生的68类非平衡，并检测到了最小为2.5 Mb的非平衡片段及可以检测出低至10%水平的嵌合体。上述研究结果表明，aCGH技术应用于胚胎植入前染色体易位遗传学诊断具有令人满意的效果。aCGH用于IVF可以获得较高的临床妊娠率［34］，且可以应用于复杂易位和全基因组异倍体筛查［35］。随着科技的发展，aCGH有望成为辅助生殖领域中经济而可靠的胚胎全基因组诊断技术。

4．“二孩”的孕前遗传咨询及产前诊断:“二孩”政策开放使许多家庭再生育的愿望得以实现，但已生育过一个表型异常或认知障碍孩子的家庭对此望而却步。而染色体微阵列分析能帮这些患者家庭找出病因，是产后及新生儿表型异常以及认知功能障碍等的一个主要的遗传评估手段。已有许多研究表明CMA技术能对不明原因的智力障碍、多发先天畸形及自闭症等进行分子诊断［36－38］。大约有12%～19%的此类患者能被CMA检测出携带染色体异常，而传统的G显带核型分析的检出率只有2%～3%，脆性X试验的检出率则是0.46%［39］。由此，美国儿科学会推荐CMA成为这些疾病的分子检测技术的第一道防线［6］。所以，可以通过CMA找出导致患者表型或认知异常的分子机制，然后给患者家庭提供相应的遗传咨询及下一胎的产前诊断，减少患儿出生的可能性。国内外的研究表明，应用CMA技术进行产前、产后遗传病诊断是提高染色体患儿检出率、查明病因并指导家庭二次生育的有效措施。

综上所述，CMA是当前针对基因拷贝数变异及致病基因多态性的最好的一种高通量扫描及基因分型技术，可以用于多种疾病的产前诊断，提高出生人口的身体素质。随着基因致病数据库的完善及芯片技术的改进，CMA这项技术还将继续迅速发展，并在医学领域发挥更多重要的作用。

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