方 晓,王康康,高维陆,张 辉,尹宗生



直接贴壁法体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞

方 晓,王康康,高维陆,张 辉,尹宗生

取90 g SPF级SD大鼠的双后肢骨髓，分别使用直接贴壁法和密度梯度离心法获得大鼠骨髓单个核细胞，用内皮培养体系EGM-2培养基进行定向诱导分化7～14 d获得大鼠内皮祖细胞。免疫荧光染色和细胞功能学鉴定内皮祖细胞，观察内皮祖细胞出现的时间和数量，CCK-8法鉴定细胞的增殖能力。与密度梯度离心法相比，直接贴壁法在内皮祖细胞出现的时间、数量和增殖能力差异有统计学意义(P<0.01)。因此，相对于密度梯度离心法，直接贴壁法培养出的内皮祖细胞分化时间更短、数量更多且增殖能力更强。

内皮祖细胞；骨髓；直接贴壁法；密度梯度离心法

Asahara et al[1]于1997年首次成功从人外周血中分离出内皮祖细胞，并指出这种细胞是血管生成的前体细胞，参与出生后血管生成，此后对内皮祖细胞的研究不断深入。内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞，有向缺血区定向归巢并分化为成熟内皮细胞、迟发的高增殖潜能等特性，在维持血管内皮完整性、修复受损血管内皮细胞、促进新生血管形成及组织修复等方面起重要作用[2]。内皮祖细胞对心脑血管疾病[3]、外周血管疾病[4]及中枢神经系统损伤[5]等的治疗有重要意义，并为缺血性疾病的治疗提供了新思路。因此，内皮祖细胞的生物学特性在临床疾病上的应用成为了医学界研究的热点。内皮祖细胞主要存在于骨髓中，由骨髓中单个核细胞分化而来，传统的培养方法是使用密度梯度离心法，该研究主要使用直接贴壁法分离培养获得目的细胞，并与密度梯度离心法进行多方面的比较。

1 材料与方法

1.1 材料 90 g健康SD大鼠，雄性，SPF级，由安徽医科大学实验动物中心提供；EGM-2完全培养基购自瑞士LONZA公司；大鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋科技有限公司；鼠纤维联接蛋白(rat fibronectin,FN )购自瑞士Gene Operation公司；CD133抗体购自美国 Biorbyt公司；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)购自美国 Invitrogen公司；异硫氰酸荧光素荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)购自美国Sigma公司；TRITC-羊抗兔IgG和FITC-羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养 SD大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后采用颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡消毒5～10 min，将处死后的大鼠置入无菌弯盘中，超净台内严格行无菌操作原则，组织剪剪开大鼠双后肢皮肤，分离肌肉组织，暴露并离断股骨、胫骨，去除骨四周附着的软组织，注意尽可能多保留骨髓含量最丰富的两侧干骺端。用注射器抽吸10 ml PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔，骨髓冲洗液不锈钢滤网过滤，移液管吹打，得到均匀的骨髓悬液。将所得骨髓悬液分成两份，一份加入红细胞裂解液后离心重悬制成1×106/ml的细胞悬液，接种到提前铺有FN的6孔板中；另一部分按照淋巴细胞分离液说明书使用密度梯度离心法获得单核细胞并制成1×106/ml的细胞悬液，接种到铺有FN的6孔板中。每孔加入含EGM-2培养基，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中进行培养。接种48 h后首次换液，弃未贴壁细胞，加入新鲜培养基后继续培养，每隔2～3 d换液，加入新鲜培养基，在倒置显微镜下动态观察培养过程中细胞形态的变化；接种10～20 d，待原代细胞逐渐融合至80%，按1 ∶2或1 ∶3比例进行细胞传代。

1.2.2 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定 首次换液后，每日在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照记录。待每孔细胞形态变为梭形、分化成内皮祖细胞时，用细胞计数板统计每孔细胞数量。

1.2.2.2 免疫荧光鉴定 取第三代分离培养的细胞进行免疫荧光法鉴定Flk-1和CD133的表达。将第三代分离培养的细胞制成细胞悬液，以1×106/ml的细胞浓度接种于已行FN包被的24孔培养板中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中约24 h，使内皮祖细胞贴壁良好，完成爬片。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，0.2% Triton X-100作用10 min后，PBS洗3次，加入羊血清室温封闭30 min，倾去羊血清，PBS冲洗3次，加入兔抗大鼠Flk-1抗体(1 ∶50)和小鼠抗大鼠CD133抗体(1 ∶50)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，空白对照用PBS代替一抗。加入TITC标记的山羊抗兔抗体和FITC标记的山羊抗小鼠抗体，避光室温放置2 h，PBS洗3次。每孔加入DAPI 100 μl，避光室温放置5 min，PBS洗3次，在载玻片上滴加抗荧光淬灭液封片后荧光显微镜下观察。

1.2.2.3 细胞功能学鉴定 同以上方法获得贴壁的内皮祖细胞，每孔加入DiI-ac-LDL浓度为10 μg/ml的EGM-2完全培养基500 μl，37 ℃避光孵育4 h后弃培养液，PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每孔中加入FITC-UEA-1，37 ℃避光孵育1 h后弃去多余染料，PBS洗3次。每孔加入DAPI 100 μl，避光室温放置5 min，PBS洗3次，在载玻片上滴加抗荧光淬灭液封片后荧光显微镜下观察。

1.2.3 内皮祖细胞增殖能力的鉴定 自首次换液后，每日倒置显微镜下观察细胞生长情况。记录出现梭形细胞的时间和细胞铺满瓶底的时间。分别取生长状态良好的第3代细胞胰酶消化后制作成单细胞悬液，以1×105/ml的密度接种在5个96孔培养板中，每孔100 μl。从第2天开始，每24 h随机取一块板，每孔加入CCK-8试剂10 μl，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 h后置酶标仪上空白孔调零，选择490 nm波长下测各孔光密度(opticaldensity，OD)值，连续测5 d，以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 刚分离获得的细胞为圆形(图1A)，体积较小,悬浮于培养液中。培养48 h后,弃去未贴壁细胞，直接贴壁组镜下可见贴壁细胞呈梭形或多角形(图1B,箭头所指为梭形细胞)，核呈椭圆形, 部分细胞形成集落，也有部分长梭形细胞首尾相连排列成直线状。梯度密度离心组镜下见大量小而圆的贴壁细胞，未见明显梭形或多角形细胞，直至培养96 h后见贴壁的梭形或多边形细胞。直接贴壁法首次出现梭型形态细胞的时间为(49±1.55)h，而密度梯度离心法首次出现梭型形态细胞的时间为(95.5±2.26) h，两者相比差异有统计学意义(t=41.59，P<0.01)。培养1周后，直接贴壁组细胞汇合度约80%(图1D)，密度梯度离心组细胞汇合度小于50%(图1C)。待贴壁细胞完全分化成内皮祖细胞时，直接贴壁组细胞数量为(82.17±1.48)×104个每孔，密度梯度离心组细胞数量为(62.08±0.92)×104个每孔，两者相比差异有统计学意义(t=28.25，P<0.01)。

图1 内皮祖细胞生长情况 ×200

A：刚分离获得的单核细胞；B：48 h已开始分化的内皮祖细胞；C：7 d密度离心组内皮祖细胞；D：7 d直接贴壁组内皮祖细胞

2.2 内皮祖细胞的细胞表型鉴定 将获得细胞诱导培养后行免疫荧光染色，直接贴壁法和密度梯度离心法获得的细胞染色皆为Flk-1和CD133双阳性，红色为Flk-1阳性，绿色为CD133阳性，蓝色为DAPI对核的染色(图2)，符合内皮祖细胞的免疫荧光鉴定。

图2 内皮祖细胞免疫荧光鉴定结果 ×200

2.3 细胞功能学鉴定 将获得细胞诱导培养后行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1荧光检测，倒置荧光显微镜下观察经过两种不同方法获得的细胞摄取Dil-ac-LDL在565 nm波长激发光激发时呈现红色荧光，而其结合FITC-UEA-1在525 nm波长激发光激发时呈现绿色荧光，蓝色为DAPI对细胞核的染色(图3)，双荧光标记的细胞被认为是可以分化为内皮细胞的前体细胞。

2.4 细胞增殖能力鉴定 在原代培养中，直接贴壁组在首次48 h换液即可见梭形或多角形形态的细胞，密度梯度离心组在96 h才开始出现梭形形态细胞。根据CCK-8法所绘制的生长曲线显示，直接贴壁组OD值为0.251±0.067，密度梯度离心组OD值为0.225±0.049，细胞原代培养后两组细胞增殖能力比较差异有统计学意义(t=3.37，P<0.05)，见图4。

图3 细胞功能学鉴定 ×200

A：摄取Dil-ac-LDL的细胞；B：结合FITC-UEA-1；C：DAPI标记的细胞核；D：合成图像

图4 CCK8法检测内皮祖细胞增殖能力

3 讨论

分离获得内皮祖细胞可以有很多来源部位，成人外周血、脐血、脾脏及骨髓等组织中均存在内皮祖细胞，其中，骨髓中内皮祖细胞数量最多[6]，大约是外周血中的内皮祖细胞数量的500倍。由于目前内皮祖细胞表面缺乏特异性表面标志物，学术界对内皮祖细胞的鉴定有较大争议，但是大多数人认为Flk-1和CD133双阳性和吞噬Dil-ac-LDL及结合FITC-UEA-1实验双阳性的细胞可以被认为是内皮祖细胞[7]，本实验采用该方法来鉴定内皮祖细胞。

目前,在体外分离内皮祖细胞的方法有很多种，主要有密度梯度离心法和免疫磁珠分选法[8]。免疫磁珠分选法主要采用CD34或CD133抗体，此方法最大的优点是可以收集到纯度较高的内皮祖细胞[9]。但是目前内皮祖细胞缺乏特异性的表面标志物，同时免疫磁珠分选法要求实验条件较高、操作复杂、价格昂贵、获得细胞量少，因此难以推广。然而密度梯度离心法相对于免疫磁珠分选法操作简单，使用方便[10]，但可能获得的细胞纯度低，只能将骨髓中整个单核细胞(包括内皮祖细胞)分离出来，并包括部分血小板、成纤维细胞等。虽然密度梯度离心法操作相对简单，但是在操作过程中需要对细胞进行反复离心，对细胞损伤较大。相对于其他原代细胞，内皮祖细胞非常脆弱，在后期诱导培养过程中贴壁分化需要较长时间、增殖缓慢，这些可能和在提取过程中反复离心有很大关系。因此先使用红细胞裂解液去除骨髓中的大量红细胞，然后将获得的标本直接接种在6孔板里进行诱导培养，通过多次的传代纯化得到纯度较高的内皮祖细胞。通过免疫荧光鉴定和细胞功能学检测，由此两种方法获得的细胞皆是内皮祖细胞。并且直接贴壁法实验操作更加简单，获得的细胞增殖能力更强，可以为后期实验方便快捷的提供更多优质的内皮祖细胞。

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Isolation and culture of endothelial progenitor cell by direct adherent methodinvitro

Fang Xiao, Wang Kangkang, Gao Weilu,et al

(DeptofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

The bone marrow taken from both hindlimbs of SD rats was divided into two parts, mononuclear cell was obtained by direct adherent method and density gradient centrifugation, respectively. Endothelial progenitor cell(EPC) was induced to differentiate from mononuclear cell when cultured 7 to 14 days in EGM-2. EPC was identified by immunofluorescence staining and experimental study of cell function; number of EPC and the time of EPC appeared were recorded; proliferation ability was examined by CCK-8 method. The time when EPC first emerged, number of EPC, and proliferation ability in direct adherent group were significantly than those in density gradient centrifugation group. Therefore, compared with density gradient centrifugation, the cell isolated by direct adherent method could get more cells, need less time to differentiate into EPC and have bigger proliferation potential.

endothelial progenitor cell；bone marrow；direct adherent method；density gradient centrifugation

国家自然科学基金(编号：81171173)

安徽医科大学第一附属医院骨关节与骨肿瘤科，合肥 230022

方 晓，男，硕士研究生； 尹宗生，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：yinzongsheng1961@sina.com

时间：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.034.html

R 394.26

A

1000-1492(2016)11-1696-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.034

2016-06-27接收