牛 坚，王 月，王人颢，刘 斌



Tim 3对poly(I ∶C)介导的小鼠Kupffer细胞分泌细胞因子的影响

牛 坚，王 月，王人颢，刘 斌

目的 探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim 3)对poly(I ∶C)活化的小鼠肝Kupffer细胞调节作用并探讨其相关机制。方法 将真核表达质粒pcDNA3.1-Tim 3转染小鼠肝Kupffer细胞，以Realtime PCR和Western blot法验证Tim 3在小鼠肝Kupffer细胞的表达。通过ELISA法检测质粒pcDNA3.1-Tim 3，并使用Tim 3阻断型抗体和核转录因子kappa B(NF-κB)抑制性配体对poly(I ∶C)活化的小鼠肝Kupffer细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)]产生影响，Western blot法检测NF-κB p65、IκBα蛋白表达。结果 Tim 3抑制小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β，Western blot结果显示其降低小鼠肝Kupffer细胞NF-κB p65蛋白和提高IκBα蛋白表达。结论 Tim 3通过NF-κB通路参与了poly(I:C)诱导小鼠肝Kupffer细胞活化的调节。

Tim 3；Kupffer细胞；小鼠

聚肌胞苷酸(poly I ∶C)是一种双链RNA病毒模拟物，能与 Toll样受体3(Toll-like receptor,TLR3)结合，后者主要表达在巨噬细胞和树突状细胞上。位于肝脏的巨噬细胞又称Kupffer细胞，研究[1-2]表明，poly I ∶C能诱导肝Kupffer细胞的过度活化，产生很多种炎性因子。最近实验显示T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3( T cells immunoglobulin and mucin family-3,Tim 3)是炎症反应的一种重要调节分子，提供抑制性信号，对Kupffer细胞活化有重要的调控作用[3]。该研究首先通过将表达Tim 3的质粒转染入小鼠Kupffer细胞，检测其产生炎性因子的变化，进一步研究产生这些改变的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验材料 6～8周龄 SPF级健康Balb/C小鼠，22～24 g，购自中国科学院上海实验动物中心。真核表达载体pcDNA3.1-Tim 3由Sanchez-Fueyo A教授赠送。兔抗鼠Tim 3抗体以及同型对照抗体，核转录因子kappa B (nuclear factor of kappa B,NF-κB)p65单抗、NF-κB抑制蛋白α(NF-κB inhibitor alpha,IκBα)单抗购自美国Santa Cruze公司； LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；poly(I ∶C)、NF-κB抑制剂PDTC购自美国Sigma公司；小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA检测试剂盒购自美国eBiosence 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Kupffer细胞分离、培养 参照文献[4]方法对小鼠肝脏Kupffer细胞进行分离、纯化。培养液RPMI 1640中含10%小牛血清，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 检测poly(I ∶C)介导的小鼠肝脏Kupffer细胞Tim 3的表达 小鼠肝脏Kupffer细胞调整浓度至1×105/ml，接种于24孔培养板中，37 ℃、5% CO2培养过夜；加入终浓度为0、10、20、50 ng/ml poly(I ∶C)继续培养24 h，收集细胞用于Realtime PCR法检测Tim 3的表达。Tim 3上游引物：5′-TTGACCCTGGCACTTATC-3′，下游引物：5′-ATGGAGCATTTCAATGTAGCAT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GATGCAGGGATGATGTTCT-3′。具体操作步骤见参考文献[5]。同时Western blot检测Tim 3蛋白的表达。

1.2.3 小鼠Kupffer细胞转染质粒pcDNA3.1-Tim 3后Tim 3的表达 将小鼠Kupffer细胞悬液接种于24孔板上，接种密度为1×105个/孔，放入37 ℃、5% CO2培养。转染前更换成不含血清的RPMI-1640，采用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂，按使用说明书进行转染实验。转染质粒后的细胞孵育6 h换成正常培养液24 h，收集细胞。Realtime PCR法检测Tim 3在mRNA水平的变化，具体步骤如参考文献[5]。Western blot法检测Tim 3在蛋白水平的变化，一抗10 ml(1 ∶1 000稀释)室温孵育2 h，二抗10 ml(1 ∶5 000稀释)室温孵育2 h后具体步骤如参考文献[5]。

1.2.4 Tim 3过表达对poly(I ∶C)活化小鼠Kupffer细胞炎性因子分泌的影响 将1.2.3转染质粒pcDNA3.1-Tim 3的Kupffer细胞，调整浓度至5×104/ml，接种于96孔培养板中，每组3个复孔，37 ℃、5% CO2培养过夜；加入poly(I ∶C)至终浓度50 ng/ml，于24 h后收集培养上清液用于TNF-α、IL-6 、IL-1β检测。具体步骤如参考文献[5]。

1.2.5 Western blot法检测Tim 3对小鼠的Kupffer细胞NF-κB P65蛋白表达的影响 收集1.2.3中的细胞裂解液，Western blot法检测NF-κB P65蛋白水平的变化，操作过程如参考文献[5]。一抗10 ml(1 ∶2 000)室温孵育2 h，二抗10 ml(1 ∶4 000)室温孵育2 h。

1.2.6 抑制NF-κB通路后对Tim 3抑制小鼠Kupffer细胞因子产生的影响 将小鼠Kupffer细胞加入吡咯烷二硫基甲酸盐(PDTC)至终浓度30 μmol/L，预处理0.5 h，转染质粒pcDNA3.1-Tim 3，接种于96孔培养板中；最后加入poly(I ∶C)至终浓度50 ng/ml，于24 h收集培养上清液，ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL -6 含量。检测方法如参考文献[5]。

1.2.7 抑制NF-κB通路对封闭Tim 3后小鼠Kupffer细胞因子产生的影响 将转染 pcDNA3.1-Tim 3的Kupffer细胞，调整浓度至5×104/ml，接种于96孔培养板中；37 ℃、5% CO2培养过夜；弃去原有培养基，加入兔抗鼠Tim-3单克隆抗体或同型对照羊IgG 5 ng/ml的培养基，同时加入PDTC至终浓度30 μmol/L，培养24 h收集上清液用于TNF-α、IL-1β、IL-6检测。检测方法如参考文献[5]。

1.2.8 细胞培养及分组 细胞用含10%的小牛血清RPMI 1640常规培养，实验所用细胞均处于对数生长期，分成3组，包括正常对照组(仅加等量转染试剂)、pcDNA3.1-Tim 3组和pcDNA3.1组，每组细胞设3个复孔。

2 结果

2.1 光镜下Kupffer细胞形态观察 分离出的Kupffer细胞随着培养时间的延长，细胞形态结构会发生改变。刚分离的Kupffer细胞悬浮于培养液中，呈圆球形，具有很强的折光性，形态、大小较一致；培养0.5 h后细胞黏附培养板底部，部分细胞开始贴壁生长，培养6 h后，大多数细胞已贴壁生长，少数细胞开始伸展；24 h后，贴壁细胞已完全伸展，体积明显增大，细胞形态呈典型星形、多边形或梭形，见图1。

图1 原代培养小鼠Kupffer细胞 ×200

2.2 poly(I ∶C)介导的小鼠Tim 3的表达 Realtime PCR法检测结果显示10 ng/ml(F=20.23、P=0.019)、20 ng/ml(F=29.16、P=0.011)和50 ng/ml(F=36.37、P=0.002)的 poly(I:C)介导的小鼠Kupffer细胞的Tim 3 mRNA含量较0 ng/ml poly(I ∶C)组显著增高(P<0.05)，见图2。Western blot法检测结果显示10 ng/ml(F=20.16、P=0.018)、20 ng/ml(F=28.26、P=0.014)和50 ng/ml(F=36.87、P=0.002)的 poly(I ∶C)介导的小鼠Kupffer细胞的Tim 3蛋白表达较0 ng/ml poly(I ∶C)组显著增高(P<0.05)，见图3。

图2 Tim 3 mRNA的相对表达水平

图3 Tim 3蛋白的相对表达水平

2.3 转染质粒pcDNA3.1-Tim 3小鼠Kupffer细胞Tim 3的表达 Realtime PCR和Western blot分别检测正常对照组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-Tim 3组的Tim 3 mRNA的相对表达量，与pcDNA3.1组、正常对照组比较，pcDNA3.1-Tim 3组的Tim 3 mRNA表达显著增加，pcDNA3.1组mRNA表达量为其21%(F=46.17，P=0.012)，正常对照组mRNA表达量为其12%(F=66.35，P=0.002)，见图4。pcDNA3.1-Tim 3组中Tim 3蛋白的表达明显高于正常对照组，经灰度扫描分析，pcDNA3.1组蛋白表达量为其31%(F=39.24，P=0.019)，正常对照组蛋白表达量为其32%(F=36.35，P=0.019)。见图5。

2.4 Tim 3过表达对poly(I ∶C)活化小鼠Kupffer细胞的炎性因子表达影响 ELISA结果显示，转染质粒pcDNA3.1-Tim 3的小鼠Kupffer细胞经poly(I ∶C)活化后炎性因子表达发生了变化，pcDNA3.1-Tim 3组 的TNF-α、IL-6、IL-1β分泌炎性因子较pcDNA3.1组(F=30.16、P=0.023)、正常对照组(F=33.36、P=0.021)明显下降，这表明Tim 3能抑制Kupffer细胞的活化，见图6。

图4 Tim 3 mRNA的相对表达水平

图5 Tim 3蛋白的相对表达水平(n=3)

A：pcDNA3.1-Tim 3组；B：pcDNA3.1组；C：正常对照组；与正常对照组比较：*P<0.05

图6 Tim 3过表达对小鼠Kupffer细胞炎性因子表达的影响

2.5 Tim 3对小鼠Kupffer细胞的NF-κB P65、IκBα蛋白表达的影响 pcDNA3.1-Tim 3转染小鼠Kupffer细胞后经poly(I ∶C)刺激，Western blot检测显示，pcDNA3.1-Tim 3组细胞的p65蛋白的表达从poly(I ∶C)刺激6 h后均低于pcDNA3.1组、正常对照组，见图7；而IκBα的表达量与之相反，随着时间的延长其表达量逐渐升高，从poly(I ∶C)刺激6 h后高于正常对照组细胞，见图8。可见Tim 3抑制了NF-κB通路的活化。

图7 Tim 3对Kupffer细胞NF-κB P65蛋白表达的影响

与正常对照组比较：*P<0.05

图8 Tim 3对Kupffer细胞IκBα蛋白表达的影响

2.6 抑制NF-κB通路后对Tim 3上调小鼠Kupffer细胞炎性因子产生的影响 NF-κB抑制性配体PDTC预处理转染质粒pcDNA3.1-Tim 3的小鼠Kupffer细胞30 min后，经poly(I ∶C) 刺激后，ELISA结果显示PDTC预处理组TNF-α、IL-6、IL-1β分泌较正常对照组无明显变化，见图9，PDTC未处理组TNF-α、IL-6、IL-1β分泌减少，差异有统计学意义，见图6。可见Tim 3通过NF-κB通路抑制炎性细胞因子分泌。

图9 NF-κB通路对小鼠Kupffer细胞炎性因子表达的影响

2.7 阻断NF-κB通路逆转Tim 3阻断型抗体对poly(I ∶C)介导的Kupffer细胞分泌细胞因子的促进作用 为了研究阻断Tim 3是否通过NF-κB通路影响TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌， 利用PDTC预处理pcDNA3.1-Tim 3组30 min后，然后加入Tim 3阻断型抗体处理，poly(I ∶C)刺激后，收集培养上清液，ELISA结果显示，PDTC未处理组，Tim 3阻断型抗体组与未加Tim 3阻断型抗体组比较，TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌增加(P<0.05)，见图10A；而PDTC预处理组，Tim 3阻断型抗体组与未加Tim 3阻断型抗体组比较，TNF-α、IL-6、IL-1β分泌差异无统计学意义，见图10B。

3 讨论

Kupffer细胞是指存在于肝脏血窦内皮间的巨噬细胞，活性程度很高，在细菌脂多糖等激活下，可以释放多种细胞因子，从而激活多种炎性细胞，共同在肝脏的炎症反应中发挥作用[6-7]。肝衰竭综合征的临床特点和结局取决于Kupffer细胞的比例、释放炎性因子的种类[8]。因而，深入肝巨噬细胞的活化及调控机制对治疗肝损失具有重要意义。

Toll样受体(Toll like receptor,TLR)蛋白代表了一类保守的受体家族，分别识别不同的抗原。其中TLR3能专一性地识别poly(I ∶C)，激活NF-κB通路，促发炎症因子及辅助刺激分子的释放，调节机体单核/巨噬细胞。TLR下游信号通路的关键节点就是NF-κB蛋白，在免疫反应中发挥重要作用，最突出的生物学功能是促进细胞因子合成和释放。poly(I ∶C)通过细胞膜表面的TLR3激活炎性细胞，核内NF-κB通路被激活，合成大量炎性细胞因子并释放到胞外，趋化粒细胞、巨噬细胞，同时使得毛细血管通透性增加，引起炎症反应[9-10]。

图10 阻断NF-κB通路逆转Tim 3阻断型抗体对Kupffer细胞分泌炎性因子的促进作用

A：PDTC未预处理组；B：PDTC预处理组；与Tim 3阻断型抗体预处理比较：*P<0.05

Tim 3属于T细胞免疫球蛋白及黏蛋白(Tim)家族成员，是活化的Th1细胞表面的共刺激分子[11]。Tim 3 和配体Gal9结合构成Tim 3-Gal9 信号通路，引起T 细胞的凋亡，并能激活天然免疫细胞，从而在先天性免疫反应和获得性免疫反应中发挥重要作用。Tim 3分子对Th1细胞起负性调节作用，参与了特异性免疫应答。近年来研究[12-14]显示，Tim 3在巨噬细胞、DC、肥大细胞等天然免疫细胞表面有表达，在先天性免疫反应和获得性免疫反应中发挥重要作用。

在Kupffer细胞中，Tim 3通路是否与poly(I ∶C)/ TLR3活化NF-κB蛋白的调节有关联，本实验结果显示poly(I ∶C)能够诱导小鼠肝Kupffer细胞中Tim 3 mRNA的表达，并且随着poly(I ∶C)浓度的增加，Tim 3 mRNA明显升高。

鉴于Tim 3基因在poly(I ∶C)活化的小鼠肝Kupffer细胞中的表达及与NF-κB通路间的有调控关系，本研究应用真核表达载体pcDNA3.1-Tim 3转染小鼠肝脏Kupffer细胞，Realtime PCR及Western blot法检测结果表明构建的pcDNA3.1-Tim 3质粒有效表达Tim 3 mRNA和蛋白。用pcDNA3.1-Tim 3调高小鼠肝脏Kupffer细胞Tim 3的表达后，从细胞水平来观察相关细胞因子的变化，实验结果提示TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著下降，表明Tim 3抑制小鼠肝脏Kupffer细胞炎性因子的分泌。Western blot检测显示，pcDNA3.1-Tim 3组细胞的NF-κB蛋白的表达明显低于对照组细胞，可见Tim 3抑制了NF-κB通路的活化。

为了进一步探讨过表达Tim 3通过NF-κB通路抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，利用NF-κB抑制性配体预处理小鼠Kupffer细胞后转染pcDNA3.1-Tim 3，经poly(I ∶C)活化，显示NF-κB抑制性配体未处理组与处理组细胞比较，TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌明显下调。

在上面研究的基础上，为了明确阻断Tim 3是否通过NF-κB通路影响TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，利用NF-κB抑制性配体预处理小鼠Kupffer细胞，然后加入Tim 3阻断型抗体处理，经poly(I ∶C)活化后，NF-κB抑制性配体未处理组，Tim 3阻断型抗体(+)组与Tim 3阻断型抗体(-)组比较，TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌增加；而NF-κB抑制性配体处理组，Tim 3阻断型抗体(+)组与Tim 3阻断型抗体(-)组比较，TNF-α、IL-6、IL-1β分泌差异无统计学意义，进一步说明了Tim 3通过NF-κB通路抑制小鼠Kupffer细胞的炎性因子的分泌。

在本研究中，成功实现了采用真核表达质粒pcDNA3.1-Tim 3转染小鼠Kupffer细胞，并观察到Tim 3通过NF-κB通路对poly(I ∶C)活化的小鼠Kupffer细胞的炎性因子分泌的抑制作用，本实验结果为进一步深入阐明Kupffer细胞活化的调控机制提供了帮助，研究该分子靶标对临床诊断肝损伤进程和治疗有重要意义，有望为肝损伤的诊断和治疗提供新思路。

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Tim 3 affecting mice liver Kupffer cells secretion by poly(I ∶C) activation

Niu Jian, Wang Yue, Wang Renhao, et al

(DeptofGeneralSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002)

ObjectiveToinvestigatetheadjustmentroleofTcellimmunoglobulinandmucinfamily-3(Tim3)inKupffercellsactivationandtherelatedmechanism.MethodsTransfectedthepcDNA3.1-Tim3plasmidintoKupffercells.Tim3expressioninKupffercellwasexaminedbyRealtimePCRandWesternblot.PlasmidpcDNA3.1-Tim3,Tim3blockingantibodiesandNF-κBinhibitoryligandsonmiceliverKupffercellactivationfactor(TNF-α,IL-1β,IL-6)weremonitoredbyELISAtest.NF-κBandIκBαproteinswereexaminedbyWesternblot.ResultsTim3couldinhibitKupffercellsexpressionofTNF-α,IL-6,IL-1β.TheresultsshowedthatitreducedtheexpressionofNF-κBp65proteinandincreasedIκBαproteininthemouseliverKupffercells.ConclusionTim3isinvolvedintheregulationofKupffercellsactivationthroughNF-kappaBandIκBαprotein.

Tcellimmuneglobulinandmucinfamily-3;Kupffercell;mice

天晴肝病研究基金(编号：CFHPC20132020)；江苏省333高层次人才培养(编号：Ⅲ-2290)；徐州市推动科技创新专项资金项目(编号：KC14SX011)

徐州医学院附属医院普外科，徐州 221002

牛 坚，男，副教授，副主任医师，责任作者，E-mail:njnj_001@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.007.html

R 392

A

1000-1492(2016)11-1584-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.007

2016-06-15接收