陈 娜，方成武，程 磊，于 娇

(1.安徽中医药科学院 亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800)



白及人工种子制作与炼苗移栽研究

陈 娜，方成武，程 磊，于 娇

(1.安徽中医药科学院 亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800)

为了建立白及人工种子制作方法，考查相关因素的影响，摸索炼苗移栽的关键技术，为白及繁育提供一条新途径。以不同萌发时期的白及种子作为包埋材料，考查包埋时期、人工胚乳、种皮组分对人工种子萌发和成苗及苗重的影响。试验采用L9(34)进行正交筛选出最佳的人工胚乳：MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.25mg/L)+30g/L土豆汁。同时得出：所选配方的胚乳中，白及均能萌发，但添加30g/L的土豆汁能显著提高成苗率。较好的人工种皮组分为：3%海藻酸钠+ 0.4mol/LCacl2+ 10g/L纳米SiO2。白及试管苗移栽基质以碎木屑与土壤按1:2的比例，成活率最高。结论 优化了野生白及人工种子制备的基本方法，制定炼苗的标准，提高了炼苗的成活率，同时得出白及有无假鳞茎及假鳞茎的大小是决定移栽能否成活的关键条件。

白及；人工种子；试管苗；炼苗移栽

白及Bletillastriata(Thunb.exA.Murray)Rchb.f为兰科Orchidaceae白及属多年生药用草本植物[1]白及的干燥块茎入药，具有收敛止血，消肿生肌的作用。用于咯血止血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂；肺结核咯血，溃疡病出血[2]。通过走访调查发现：由于白及市场需求的扩大，安徽亳州药材市场白及价格目前为900元/公斤。我国大部分地区的野生白及遭到过度采挖，濒临灭绝。但白及种子细小如粉尘，无胚乳，自然状况下很难萌发，繁殖困难。为此，人工快繁白及种苗已成为解决白及资源匮乏的主要途径。鉴于亳州本地已有部分企业开始白及的规模生产，白及种苗的需求量猛增。本研究的目的在于建立一套白及种苗快繁技术及易于推广的移栽技术。

1 试验材料

成熟未开裂的白及蒴果(图1)由全国第四次中药资源普查岳西县普查队由安徽岳西县采回，经亳州职业技术学院方成武教授鉴定为兰科(Orchidaceae)白及属白及Bletillastriata(Thunb.exA.Murray)Rchb.f.

2 试验方法

2.1 白及蒴果的无菌处理与萌发

将采回的成熟未开裂的果荚流水下冲洗5 min，在无菌超净工作台上用75%酒精擦拭干净后，用0.1%的升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗干净，灭菌的滤纸吸取多余水分，将蒴果前后两端切去，从中间切开，用接种勺将种子均匀的播撒于未添加激素的MS液体(蔗糖25 g/L)和未加激素的MS固体(蔗糖25 g/L)培养基上。在温度为25±2 ℃，光照强度2 500 lx，光照时间为12 h/d的条件下进行培养。

2.2 白及种胚包埋时期的筛选

用上述条件下培养萌发7 d、14 d、21 d、28 d的种胚作为包埋材料，考察包埋时期对人工种子的影响。

2.3 白及人工胚乳和种皮的筛选

2.3.1 人工胚乳的筛选

图1 白及果荚

以萌发21 d的白及种子为材料，3%的海藻酸钠溶液+0.4 mol/L Cacl2+10 g/L纳米SiO2作为人工种皮，考察最佳人工胚乳的组成。在无菌超净工作台上，将萌发的白及种子浸泡在含3%的海藻酸钠的胚乳溶液中。浸泡时间：5 min。采用吸管轻轻汲取包有白及种子的半凝胶状态的海藻酸钠注入含0.4 mol/L 的Cacl2+10 g/L纳米SiO2的混合溶液中，确保每颗人工种子只包裹一个原球茎，15 min后，将形成的人工种子用无菌水冲洗2～3次，置于无菌纸上吸去人工种子表面水分。将制作好的人工种子置于未加激素的MS培养基中，进行培养，培养温度(25±2) ℃ ，光照时间12 h/d，光照强度2 000～2 500 lx，21 d后观察萌发率、45 d后观察成苗率。每瓶接种8～10粒人工种子，每三瓶为一组，每组处理重复3 次。另一部分人工种子播种于灭菌后的基质中，观察萌发及生长发育的过程。

萌发标准为包埋在人工基质中的白及原球茎能分化出叶片，突破种皮，并能继续生长，萌发率= 萌发种子数/播种数×100%。以第一片真叶突破种皮为萌发标准，萌发的整株幼苗完全突破种皮，苗的根部稍膨大和1～2条较小的根为成苗标准，成苗率= 苗数/播种数×100%。人工胚乳以MS为基本培养基，设定NAA(0.125、0.25、0.5 mg/L)， 6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)，土豆汁(20、25、30 g/L)根据上述3因素3水平，不考虑交互作用，利用正交表L9(34)进行正交试验。

2.3.2 种皮的筛选

按2.3.1的方法，将萌发21 d的白及种胚浸泡于上述试验筛选的最佳人工胚乳中，考察不同种皮对白及人工种子形成和生长发育的影响。通过查阅文献资料[3-4]，种皮配方分别设为：(1)海藻酸钠3%+Cacl20.2 mol/L+纳米SiO210g/L；(2)海藻酸钠4%+Cacl20.2 mol/L+纳米SiO210 g/L；(3)海藻酸钠3%+Cacl20.4 mol/L+纳米SiO210 g/L；(4)海藻酸钠4%+Cacl20.4 mol/L+纳米SiO210 g/L。每组处理8～10粒人工种子，每处理重复3次。成苗后，测量90 d时的单株苗重。

2.4 白及试管苗的移栽

当白及试管苗株高5～7 cm，假鳞茎直径约0.5 cm并有2～3条较长的根时，将试管苗从培养瓶中用镊子轻轻取出，流水下洗去培养基，用吸水滤纸吸取植株表面水分，称重后，移栽到经灭菌的基质中，采用碎木屑、土壤、珍珠岩三种基质按不同比例(表1)配比，进行移栽炼苗，保持基质湿润，空气湿度在80%左右，每天喷水4～5次，进行室内炼苗移栽。室内炼苗20 d后，再移栽到室外进行种植。30 d后统计成活率。

3 结果与分析

3.1 白及蒴果的无菌处理与萌发

为了获得无菌培养体系，选择灭菌效果好，对试验材料杀伤力尽可能小的药剂和方法尤为重要。灭菌蒴果时注意浸泡时间不可过长，否则易导致蒴果开裂，开裂后灭菌困难，种子萌发率降低。而且开裂后种子粘在一起，不易控制播种密度，继代培养时难以保证每粒人工种子包含一个拟原球茎。不同培养基中获得的拟原球茎的状态有一定的区别，MS液体中形成的拟原球茎分布均匀，颗粒较小，不易操作，色泽较暗，包埋后分化困难。MS固体培养基中形成的拟原球茎部分有粘成团块，颗粒较大，但色泽鲜绿，包埋后易分化成苗。王增利在铁皮石斛原球茎悬浮培养技术研究中也有类似报道[5]。最终选择固体MS中萌发的单个鲜绿色原球茎进行包埋。

3.2 白及种胚包埋时期筛选结果

试验发现种子萌发21 d后，是种胚包埋的最佳时期。萌发7 d的种子，种子由黄褐色变成绿色，进行了吸水膨胀，但种胚过小，包埋时操作困难。萌发14 d的已经有了初步的分化，包埋后逐渐变褐色，死亡较多。对萌发21 d的种胚进行包埋，种胚绿色，呈现一定的极性，大小适宜，易形成规则的球体。萌发28 d的种子已经分化出第一片叶，浸在海藻酸钠溶液中体积过大，不易形成规则的球体。选择萌发21 d的种胚作为包埋材料最适宜。

3.3 白及人工胚乳及种皮的筛选结果

通过正交试验筛选白及人工胚乳配方，试验结果如表1所示。

在各种配方的胚乳中，萌发率都达到85%以上。3号、5号、6号三个配方中，萌发率均超过90%，其中3号胚乳配方中萌发率最高达93.1%。从成苗情况看，配方3号、5号、7号的成苗率分别为68.9%，77.4%，71.8%。

通过正交试验的直观分析表，三种因素对白及人工种子萌发的影响以6-BA和土豆汁为主，NAA的影响较小。经方差分析：不同组合的胚乳配方对白及种子萌发率无显著影响。从成苗情况看，土豆汁是成苗的主要影响因素，6-BA次之，而NAA的影响最不明显。从直观分析表的均值分析：A2B2C3是成苗的最佳组合，这与本组实验的实际成苗率最高的数据是一致的。综合萌发率和成苗率的情况以及三种因素对成苗的影响，最终确定A2B2C3是白及人工种子的最佳胚乳配方并以海藻酸钠3%+ Cacl20.4 mol/L+纳米SiO210 g/L作为种皮配方，进行验证试验，将形成的白及人工种子(图2)直播于MS和MS+30%土豆汁的培养基上，都能萌发，生长速度较快，不用继代转接，可一步成苗(图3)，且试管苗粗壮，假鳞茎较大而均匀，在添加土豆汁的培养基中的种苗长势更好，单株苗平均重最高达0.630 7 g，移栽后成活率可达到90%以上(图4、5)。但在有菌的环境下进行直播，萌发率不到30%，且生长发育缓慢。

表1 不同影响因素的L9 (34)正交设计试验统计结果

图2 白及人工种子

图3 人工种子45 d成苗情况

图4 90 d的试管苗

图5 试管苗移栽

采用4种配方的种皮接种人工种子后，90 d时统计试管苗发育状况及试管苗单株苗平均重如表2所示。

表2 90 d试管苗发育状况统计

种皮配方筛选的试验结果显示：设计的四种种皮配方中，种胚均能萌发，表明在本试验所设置浓度范围内，这些因子不会或很少会影响白及人工种子的萌发。但以海藻酸钠3%+Cacl20.4 mol/L+纳米SiO210 g/L萌发较快，形成的试管苗整齐一致，假鳞茎大小、根长、根数符合成苗标准。平均单株苗重高于其他三组，故选择海藻酸钠3%+Cacl20.4 mol/L +纳米SiO210 g/L为种皮配方。

3.4 白及试管苗的移栽成活率结果统计

采用不同配比的基质对野生白及试管苗进行炼苗移栽，先在室内炼苗，然后移栽到室外，30 d后的成活率统计如表3所示。

表3 不同基质移栽试管苗后的成活率统计

结果表明：具有假鳞茎的白及试管苗(图4)移栽成活率均在86%以上，而碎木屑和土壤按1∶2混合时，成活率最高，可能是由于碎木屑腐烂过程中通过微生物分解产生大量的有机物质，为白及生长提供营养和适于白及生长的酸性环境；另外，此种混合的基质疏松，透气性和透水性能比其他组合高。土壤与珍珠岩及碎木屑与珍珠岩混合都存在浇水时珍珠岩易浮在基质表层的现象。

4 讨论

白及种子细如粉尘(图6)，自然状况下很难萌发，但通过组织培养技术萌发率可达到95%以上。兰科白及属和石斛属植物的蒴果一旦开裂，种子裸露，易受微生物侵染，表面灭菌处理时效果有限，而且灭菌剂直接接触种子，对种子具有一定杀伤作用，影响种胚的萌发；再者，微生物的代谢产物亦对种子的萌发产生负面影响[6]。优先选用成熟为未开裂的白及蒴果，将种子播种到MS固体培养基上后，吸水膨胀，21 d后可形成原球茎，成熟度较高的金黄色种子萌发率最高，将形成的拟原球茎进行包埋。包埋时间的选择对白及人工种子的萌发有很大的影响。包埋时间太早，人工种子萌发较慢，且不易成活。包埋时间太迟，原球茎已分化出叶片，制成的人工种子比较容易萌发，但制作时操作困难，很难固化成规则的球形。白及种子本身发育不完全，缺少胚乳，自然状况下萌发率极低，在MS培养基中进行萌发后，选择拟原球茎阶段进行包埋，为后期人工种子的制作提供条件。

图6 白及种子

白及的种胚包埋在所选配方的人工胚乳中均能萌发，但不同胚乳对人工种子的成苗和90 d时的单株苗的平均重有很大的影响。尤其是土豆汁对成苗的影响最为显著。土豆汁是植物组织培养中常用的天然添加物，含有丰富的维生素、氨基酸及各种酶，营养丰富，为植物生长提供一些生理活性物质，补充一些未知的微量成分，故能很好地促进植物的生长发育[7]。谢寅峰等也发现土豆汁、香蕉泥等对霍山石斛组培苗的生长发育有很好的促进作用[8]。在本实验中发现人工胚乳中添加30 g/L的土豆汁，胚状体容易分化，形成的试管苗假鳞茎大，叶色深绿，生长健壮。6-BA是植物组培中最常使用人工合成的细胞分裂素，主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。在人工胚乳中添加适量6-BA，有利于人工种子萌发形成试管苗。种皮的成分对人工种子的形成和试管苗的发育状况都有一定的影响。海藻酸钠包埋的人工种子，形成的胶体表面粘滞，当浓度过低时，人工种子极易失水，随着浓度的升高，凝胶不易形成球体，而且萌发较慢，试管苗叶子颜色变淡，较少部分出现失绿。根据设计的四种配方中，以单株苗平均重作为考察依据，配方3是最好的人工种皮。但白及人工种皮配方的优化还有待进一步的研究和提高。

保温保湿是白及炼苗移栽成功的重要因素。这与白及喜温暖、阴凉和较阴湿的环境是一致的。但是试管苗有无假鳞茎及假鳞茎的大小是移栽能否成活的关键。本实验通过正交法建立了白及人工种子制备体系，进行了移栽炼苗研究，得出白及有无假鳞茎及假鳞茎的大小是决定移栽能否成活的关键条件。同时对几种不同基质中的试管苗的成活率和生长发育进行了研究。

[1]中科院中国植物志编辑委员会.中国植物志[S].科学出版社，1999(18)：50.

[2]国家药典委员会.中国药典2015版一部[S].中国医药科技出版社，2015：103.

[3]李伟平，田莎莎，鲁光耀，等．利用人工种子技术快速繁殖白及[J].中国中药杂志，2012，11，37(22)：3386-3390.

[4]薛建平，张爱民，盛玮，等．半夏人工种子贮藏技术的研究[J].中国中药杂志，2005，30(23)：1820-1823.

[5]魏小勇.铁皮石斛原球茎悬浮培养技术研究[J].现代中药研究与实践，2004，18(4)：7-11.

[6]陈娜.两种石斛植株再生体系的构建及形态发生的研究[D].南京：南京林业大学(硕士学位论文)，2008.

[7]苏江，岑忠用，邓晰朝. 2种不同附加物对铁皮石斛增殖和生长的影响[J]．河池学院学报，2012，32(5)：9-14.

[8]谢寅峰，徐丽，张志敏，等．几种有机添加物对霍山石斛试管苗生理特性的影响[J]．西北林学院学报，2011，26(1)：77-81.

Research onDomestication Transplanting and Artificial Seeds Production of Bletilla Striata

CHEN Na, FANG Chengwu, CHENG Lei, YU Jiao

(1.InstituteofBozhouTraditionalChineseMedicine,SchoolofAnhuiTraditionalChineseMedicine,Bozhou236800,China;2.BozhouVocationalandTechnicalCollege,Bozhou236800,China)

Objective: To provide a new manufacturing method for the artificial seeds ofBletillastriata, the impact of relevant factors was examined, the key technologies of domestication and transplanting were explored. Methods: The artificial seeds ofBletillastriatawere manufactured by different time germination as the embedding materials, with consideration of the effects of entrapped period, artificial endosperm and testa components on the germination, seedling and seedling weight of the artificial seeds. Results: The best artificial endosperm made by MS+6-BA(2.0 mg/L)+NAA(0.25 mg/L)+30 g/L potato juice has been selected by Orthogonal test designed L9(34). At the same time,Bletillastriatacould germinate in different formulations of the endosperm, but for the higher seedling rate, 30 g/L potato juice can be added into the artificial endosperm. 3% sodium alginate +0.4 mol/L Cacl2+10 g/L nano-SiO2are the better artificial testa components. The highest survival rate was obtained by broken sawdust and soil according to the proportion of 1∶2. Conclusion: A basic method of artificial seeds preparation of wildBletillastriatahas been optimized for the domestication standards and higher survival rate of domestication. Meanwhile, the key condition for transplant survival is the size and presence of theBletillastriatawith fake bulb.

Bletillastriata; artificial seeds; test-tube plantlet; domestication and transplanting

2016-09-06

亳州市创新创业领军人才“中药栽培与产地加工科研团队(亳组)”(2014(21))；安徽省质量工程项目(2014jyxm530)。

陈娜(1982-)，女，安徽淮北人，讲师，硕士研究生，研究方向：药用植物发育学。

R282.5

A

1009-9735(2016)05-0063-05