崔金梅，高丽华*，刘婷

（北京食品科学研究院，北京100050）

食品中4-甲基咪唑的分析方法

崔金梅，高丽华*，刘婷

（北京食品科学研究院，北京100050）

该文介绍了食品中4-甲基咪唑的常见来源，以及4-甲基咪唑对人体健康可能存在的风险，并对近年来食品中4-甲基咪唑含量的分析方法进行了总结，介绍了各分析方法的优缺点以及在国内外的应用情况。最后对食品中4-甲基咪唑检测技术的发展进行了展望。

4-甲基咪唑；食品；分析方法；液相色谱-质谱法；气相色谱-质谱法

4-甲基咪唑（4-methylimidazole，4-MI）是一种重要的有机杂环化合物，化学分子式为C4H6N2。它是由甲基取代咪唑4位的氢形成，是一种白色至类白色结晶粉末，溶于水和乙醇，有腐蚀性。在某些食品中，碳水化合物和含胺基化合物通过美拉德反应产生一种褐变反应的过程中通常会形成4-MI，在焙烤食品、烤肉、咖啡和以亚硫酸铵为原料生产的焦糖色素中往往会存在4-MI，在食品酿造过程中也会产生4-MI。

研究表明，4-MI能导致动物长肿瘤，有可能给人体带来致癌风险。焦糖色素是一种在食品中应用范围十分广泛的着色剂，是食品添加剂中的重要一员。虽然4-MI有比较大的危害性，但只要它是合格食品添加剂焦糖中的物质，含量在允许的范围内，那么对人体将不会有太大的损害。迄今为止我国仅在食品安全国家标准GB1886.64—2015《食品添加剂焦糖色》[1]中明确了4-MI的测定方法和限量要求（4-MI≤200 mg/kg），没有制定人体每日允许摄入4-MI的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）。欧盟和世界卫生组织确定焦糖色素中4-MI的含量最高不得超过250 mg/kg。国际上尚没有4-MI的既定ADI值，也还没有涉及其他食品中4-MI的相关规定或标准。但是明确了加入焦糖色素的食品应在其标签中注明，以使其日摄入量在安全范围之内。

作为一种涉及食品质量安全的重要有机化合物，高效、灵敏和准确的4-MI检测方法对质量控制和监督非常重要。4-MI主要涉及的食品是碳酸饮料、咖啡等含有焦糖色素的饮料、饮品以及酱类、焙烤食品和焦糖色素，其相关检测方法有液相色谱法[2-8]（包括超高效液相色谱法）、液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[3，9-20]、气相色谱法（gas chromatography，GC）[21]、气相色谱质谱联用法（GC-MS）[22-31]、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）[32-33]、离子色谱法（ion chromatography，IC）[34]、二维液相色谱法（LC-LC）[35]、分光光度法（ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-Vis）[36-38]和其他方法[39]。本文对近年来发表的有关4-MI分析测定方法的文献进行了综述，相关的结论可供质量控制和监督以及标准制定部门参考。

1 食品中4-甲基咪唑含量测定的难点

4-MI是一个两性极性化合物，它的分子结构中含有一个碱性的“吡啶样的氮”和一个弱酸性的“吡咯样的氨基氮”，其pKa为7.6。4-MI分子的强极性特征增加了复杂的食品基质中提取和测定过程的难度，使得GC和LC法的直接应用都有一定的局限。高极性和碱性这些特征使得4-MI呈现出能与反相液相色谱柱填料的硅醇基发生反应和保留性不强的特征，在应用LC测定前需要采用一些办法克服这些问题，改善保留使分离的色谱峰更对称（如使用离子对试剂）。LC法测定4-MI需要采用固相萃取净化样品，且灵敏度有限。GC法测定食品中的4-MI，需要用离子对试剂对4-MI进行提取再衍生，前处理繁琐、耗时、重复性差且灵敏度并不高。并且，GC法测定4-MI所能选用的衍生试剂比较有限，且容易对分离柱的灵敏度造成影响。与GC和LC法相比，GC-MS和LC-MS法灵敏度更高，更适合食品中微量4-MI的分析测定。在实验室常用的分析方法中，薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）选择性差、灵敏度低，不太适合基质复杂的食品中微量和痕量4-MI的准确测定。分光光度法需要有相应的显色反应，且稳定性和灵敏度均较差，在实际的食品中4-MI的含量监测中应用有较大地局限性。特别要指出的是毛细管电泳仪在食品分析实验室还不够普及，因此毛细管电泳法虽然有较高的灵敏度，但在食品质量监督中的实际应用价值不高。

2 食品中4-甲基咪唑的测定方法

早在1979年日本就有焦糖中4-MI定量分析的研究报道。此后，应用反相离子对液相色谱法和薄层色谱法测定焦糖色素和食品中4-MI的方法均有报道。几十年来，随着仪器分析技术的不断发展，针对食品中4-MI的新的分析方法也被陆续报道。表1对迄今为止SCI（2000年以来收录的）和中文核心期刊（2005年以来）文献报道的食品中4-MI的测定方法进行了总结，列出了食品中4-MI的提取方法、测定方式、方法的标准曲线的线性范围、方法的检出限和回收率。

从表1可以看出，涉及LC-MS技术的测定方法最多，其次为GC-MS法和LC法。此外，毛细管电泳[32-33]、离子色谱[34]和二维液相色谱[35]在食品中4-MI的测定中均有应用，而分光光度法测定4-MI的文献[36-38]都是2010年前在中文核心期刊上发表的。显然，随着色谱、质谱、色谱质谱联用技术、色谱柱技术及其样品前处理技术的发展和仪器设备的更新和普及，特别是超高效液相色谱串级质谱技术在灵敏度、选择性和准确性以及分析速度等方面具有其他分析技术无法媲美的优势，它在食品这类复杂基质中4-MI的含量测定中应用最广泛。

如表1所示，高效液相色谱-串级质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法（包括超高效液相色谱二级质谱法）在甘草汁[9]、焦糖色素[10]、酱油[16-17，20-21]、醋[10，13，20-21]、饮料[10-12，14-16，19-20]、酱[13]、咖喱[13]、咖啡[16]、焙烤食品[18]和其他调味料[13]等食品中4-MI测定的应用中，检出限最低可达1.5 μg/kg[18，21]，定量限最低可达3.0 μg/kg[19]，回收率最低为67.5%[19]，最高达117.2%[21]，定量方法有内标法[9-11，15，18-21]和外标法[2，12-14，16-17]，使用的内标物有氘代4-MI[9，10，15，18-21]、密胺[11]。样品前处理有直接稀释进样[11，13-15，39]，也有采用先酸化再经固相萃取对4-MI进行提取净化，使用的固相萃取小柱有Waters Oasis MCX混合型阳离子萃取小柱[10，17，19-20]、StrataTMX-C含有N-乙烯吡咯烷酮的功能性聚合物吸附剂的固相萃取柱[12]、Waters C18固相萃取柱[13]和QuEChERS样品净化试剂包[18，21]。

GC-MS法在黄米酒[23]、酱油[23]、饮料[24，27]、咖啡[25]、焦糖色素[26，31]、啤酒[27]、食醋[28-29]等食品中4-MI测定的应用中检出限最低可达5μg/kg[23，25]，最低检出质量浓度可达0.6ng/mL[27]，定量限最低可达15 μg/kg[23]，回收率最低78.3%[23]，最高达114%[28]。定量方法有内标法[23-28]和外标法[29，31]，使用的内标物有氘代氨基甲酸酯[23]、2-甲基咪唑[24]、2-乙基咪唑[25-27]、N-甲基甲酰苯胺[28]。样品前处理有采用碱性硅藻土固相萃取柱提取净化[23]，有采用PDMS-DVB萃取头富集提取的顶空固相微萃取方式[24]，有采用样品碱化后用硅藻土净化[28，31]的方式，有用固相萃取柱净化提取[29]的方式，还有先采用离子对试剂双（2-乙基己基）磷酸酯对样品中的4-MI进行萃取，再用氯甲酸异丁酯进行衍生[25-27]的方式。

在LC-MS和GC-MS检测食品中4-MI的方法中，比较新的样品前处理技术如QuEChERS样品净化试剂包、具有离子交换功能的固相萃取小柱和新型色谱柱如HILIC色谱柱都有应用。这些新技术大大简化了样品处理步骤，提高了检测方法的选择性、灵敏度和准确性。

由于4-MI分子极性强，易形成氢键，因此直接测定易造成色谱峰脱尾，峰形不对称。在采用GC-MS测定前需要对食品中的4-MI先提取再衍生，而提取方式和衍生试剂的选择、提取试剂和衍生试剂的浓度、提取效率、衍生反应的pH条件、反应温度、反应时间、衍生物的提取和衍生产物的稳定性都会影响最终测定结果的准确性和精密度。与LC-MS法相比，GC-MS法样品前处理步骤更复杂、耗时更多，并且方法的灵敏度和准确性并没有太明显的优势。

在食品中4-MI的测定中，LC法和GC法样品前处理方式分别与LC-MS法和GC-MS法相似，但方法灵敏度远远低于LC-MS法和GC-MS法。

毛细管电泳法[32-33]和离子色谱法[34]测定食品中4-MI的方法检出限高于LC-MS和GC-MS，相比之下并没有明显的优势。同样，基于适合分离复杂混合物的二维液相色谱技术[37]的测定方法，其标准曲线的线性范围是20～500 mg/L，灵敏度并没有LC-MS和GC-MS高。

目前，我国食品安全国家标准GB1886.64—2015《食品添加剂焦糖色》[1]采用气相色谱-火焰离子化法测定焦糖色素中的4-MI。联合国粮农组织食品添加剂联合专家委员会标准“Caramel colours”[40]规定以2-甲基咪唑（2-MI）为内标，采用气相色谱（气液色谱）配置氢火焰检测器测定焦糖色素中的4-MI。这两种方法检出限均达到mg/kg级。陕西省食品安全地方标准DBS61 0007—2015《饮料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的测定》[41]规定采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对碳酸饮料、特殊用途饮料、茶饮料、咖啡等饮料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑进行测定。试样中的4-甲基咪唑和2-甲基咪唑经水溶解或稀释，振荡后，阳离子固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，氘代4-甲基咪唑内标法定量。该方法对4-甲基咪唑、2-甲基咪唑的定量限均为10.0 μg/kg，回收率为88.8%～119.9%。

表1 食品中4-甲基咪唑含量的分析方法Table 1 Analytical methods of 4-methylimidazole in foodstuffs

续表

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3 展望

综上所述，检测食品等复杂基质样品中4-MI含量的各种方法中，采用固相萃取法提取净化样品中的4-MI，采用超高效液相色谱串级质谱法进行分析测定在分析速度、选择性、灵敏度和准确性方面具有优势，可以作为制定相关国家标准的首选方法。应该引起关注的是相关国标方法的欠缺不利于我国含有焦糖色素食品的质量安全控制和质量监督。由于我国许多不可或缺的传统食品中都添加焦糖色素，例如酱油和酱等，因此，制定食品中4-MI测定方法的国家标准是十分必要和迫在眉睫的。

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Analytical methods of 4-methylimidazole in foodstuffs

CUI Jinmei,GAO Lihua*,LIU Ting
(Beijing Academy of Food Sciences,Beijing 100050,China)

The common sources of 4-methylimidazole(4-MI)in foodstuffs and the possible risk of 4-MI for human health were introduced in the paper.The analytical methods of 4-MI in foodstuffs were summarized.The advantages,disadvantages and application of each detection method were introduced home and abroad.Finally,the development of detection technologies of 4-MI in foodstuffs was prospected.

4-methylimidazole;foodstuffs;analytical method;LC-MS;GC-MS

TS207.5

0254-5071（2016）11-0007-08

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.002

2016-06-14

国家重点研发计划课题（2016YFD0400505）

崔金梅（1977-），女，工程师，本科，研究方向为食品检测。

*通讯作者：高丽华（1971-），女，高级工程师，本科，研究方向为食品检测。