刘晓玲，董　猛，郭红月，唐毅玲，韩景智，崔东晖

树突状细胞联合共培养细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期胃癌临床疗效观察

刘晓玲，董猛，郭红月，唐毅玲，韩景智，崔东晖

目的：探讨树突状细胞（DC）共培养细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）联合化疗治疗晚期胃癌的疗效与安全性。方法：选取66例晚期胃癌患者，随机分为观察组和对照组,每组33例患者，观察组化疗4周期后予DC-CIK生物治疗，对照组常规化疗，观察治疗前后外周血T淋巴细胞亚群、血清肿瘤标志物的改变及临床疗效,记录不良反应。结果：观察组1个月后胃癌患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例均有不同程度提高（P＜0.05）。观察组血清肿瘤标志物CEA在治疗后1个月为（11.36±2.62）ng/mL，而对照组为（22.16±13.45）ng/mL，观察组CEA水平较对照组明显下降（P＜0.05）。客观缓解率15.2%，疾病控制率33.3%。结论：DC-CIK细胞联合化疗晚期胃癌，可延缓疾病进展，改善患者免疫功能，是安全、有效的治疗方法。

树突状细胞；细胞因子诱导杀伤细胞；化疗；进展期胃癌

胃癌5年生存率仅30%左右[1]，发病早期无特异症状及体征，导致大多数患者确诊时已为进展期，晚期胃癌多数无手术价值，即便手术复发率及转移率也极高。随着分子和细胞生物技术的发展，免疫治疗成为继手术、化疗、放疗之后恶性肿瘤的第4种主要治疗方法[2]。树突状细胞（dendritic cell，DC）是一种专职抗原呈提细胞（antigen presenting cell，APC），在抗原呈提中处于核心地位，能诱导出抗原特异性细胞毒淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）反应[3]。细胞因子诱导杀伤细胞（cytokined-induced killer，CIK）来源于外周血单个核细胞，是在体外经过多种细胞因子激活和一段时间的培养获得的一群异质细胞，对肿瘤细胞的杀伤作用具有高效性和非主要组织相容性复合体限制性的特点，是一类杀瘤活性强和抗瘤谱广的新型抗肿瘤效应细胞[4]。2011年10月—2014年10月，我们观察了局部晚期无法切除或切除后复发或有远隔脏器转移的胃癌患者，探索细胞免疫的有效性与安全性。

1　资料与方法

1.1一般资料选取河北省沧州中西医结合医院外一科2011年10月—2014年10月66例胃癌患者，男40例，女26例；年龄42～70岁，中位年龄58岁。均经病理确诊，其中腺癌50例，印戒细胞癌16例。随机分为观察组和对照组各33例。见表1。入选标准：根据国际抗癌联盟（UICC）分期标准证实为III～IV期；重要脏器功能正常，无自身免疫疾病；卡氏评分＞60分；两组评分无差异性（P＞0.05）。预期生存时间超过3个月。患者或家属签署知情同意书，经医院伦理委员会批准。

表1　66例晚期胃癌患者一般资料例比较

1.2治疗方法对照组采用XELOX方案(第1 d静脉点滴奥沙利铂130 mg/m2溶于5%葡萄糖250 mL，大于2 h，第1～14 d口服卡培他滨1000 mg/m2，2次/d，21 d为1个周期)化疗，共4周期。观察组予4周期XELOX方案化疗后的第14 d，输入制备好的DC-CIK细胞。

1.3DC-CIK细胞培养自患者本人采集抗凝全血100 mL，加淋巴细胞分离液制备出单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用Ficoll淋巴细胞分离液进一步纯化，用AIMV无血清培养基调整细胞浓度（4～6）×106个/mL，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养2 h，收集非贴壁细胞和贴壁细胞。将非贴壁细胞计数并调整细胞浓度，接种于培养瓶，分别加入IFN-γ1000 U/mL。24 h后，50 ng/mL Anti-CD3和IL-2500 U/mL，继续培养，每2～3 d进行一次扩瓶传代，于第8 d收集CIK细胞。贴壁细胞计数并加入rhGM-CSF 1000 U/mL和rhIL-4500 U/mL，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每2～3 d半量换液，培养至第6 d加入TNF-α（500 U/mL），第8 d收获DCs，然后将CIK细胞和DC细胞按1∶5的比例继续培养4 d，获得DC-CIK细胞。

1.4细胞表型测定取第1 d的DCs，流式细胞仪检测DC表型，CD11c为（15.09±3.04）%，CD83为（7.02± 0.65）%为CD86为（35.1±3.96）%。取第7 d DCs流式细胞仪检测DC表型，CD11c为（25.8±0.3）%，CD83为（50.35±2.67）%，CD86为（77.06±5.2）%。取d 1 CIK细胞，流式细胞仪检测CIK细胞表型，CD8为（15.09± 2.14）%、CD3为（31.78±0.15）%，CD56为（7.08± 1.19）%，取d 12 CIK细胞流式细胞仪检测其表型，CD8为（38.89±0.35）%，CD3为（73.99±2.13）%，CD56为（19.67±6.78）%。其中CD3+、CD56+细胞达20%以上。

1.5DC-CIK治疗方案在CIK细胞培养的第9 d、10 d、11 d、12 d收集细胞，离心、洗涤后溶于生理盐水，霉菌检测试验阴性，台盼蓝染色检测细胞活力大于85%，以采血之日作为第1 d，收集第12 d时DC-DIK细胞，0.9%生理盐水溶液洗涤3次后配成100 mL液体，1 h内静点回输患者体内，每天输1次，每次回输细胞数1×109，连续5 d为1个疗程，每个疗程回输细胞总数（5～6）×109个。4～6次/年，2个月1次。

1.5流式细胞仪测定外周T淋巴细胞亚群变化于回输前1 d及治疗4周后，分别采集空腹时静脉血5 mL，行流式细胞仪检测T细胞亚群的标志CD3+、CD4+、CD8+、及CD4+/CD8+比值。

1.6疗效评价患者在接受最后一次DC-CIK细胞治疗后，复查血常规、肝肾功能、血清肿瘤标志物和外周血T淋巴细胞亚群，并进行上腹部强化CT、肺CT及腹腔彩超、ECT检查，进行不良反应及临床疗效评估。治疗1个月后再次评估，其后每3～6个月复查评估一次，随访2年。近期疗效评估按实体瘤疗效评估标准分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）、疾病进展（PD），以CR+PR计算客观缓解率（objective response rate，ORR），CR+PR+SD计算疾病控制率（disease control rate，DCR），总生存时间（overall surviral，OS）是从DC疫苗治疗到死亡或随访截止日期。观察治疗前后血常规、肝肾功能的变化，观察治疗过程中出现的不良反应如发热、皮疹、恶心、呕吐、腹泻等。

2　结果

2.1淋巴细胞亚群变化与对照组相比，观察组接受DC-CIK治疗1个月后外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞百分比及CD4+/CD8+比值均较治疗前提高。与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　2组患者外周血T细胞亚群变化（±s，%）

表2　2组患者外周血T细胞亚群变化（±s，%）

组别对照组观察组CD3+43.09±3.34 66.30±2.15 CD4+21.48±4.45 38.67±3.03 CD8+27.09±4.21 32.74±2.81 CD4+/CD8+1.03±0.45 1.47±0.90

2.2肿瘤标志物变化观察组1个月后检测血清CA19-9、CEA、CA125的表达水平，与对照组相比，治疗组CA19-9、CEA水平显著下降，CA125水平无显著变化。见表3。

表3　2组患者外周血肿瘤标志物变化（±s）

表3　2组患者外周血肿瘤标志物变化（±s）

组别对照组观察组CA19-9（ng/mL）44.02±7.35 17.39±3.79 CEA（ng/mL）22.16±13.45 11.36±2.62 CA125(KU/L) 17.62±7.54 16.03±3.38

2.3近期疗效观察组5例PR、6例SD、20例PD，客观缓解率15.2%，疾病控制率33.3%。对照组3例PR、5例SD、25例PD，客观缓解率为9.1%，疾病控制率为24.2%。见表4。

表4　2组患者近期疗效

2.4随访随访时间6～24个月，中位随访8.9个月。观察组23例死亡，10例仍在随访中。随访患者中位生存时间6.3个月，6个月生存率40%，9个月生存率31%。对照组27例死亡，6例仍在随访中。随访患者中位生存时间4.5个月，6个月生存率32%，9个月生存率21%。

2.5安全性观察组1例在DC-CIK细胞回输后出现发热，体温最高达38.3℃，1例出现乏力。均经对症处理好转。治疗前后血常规及肝肾功能均未见明显变化。

3　讨论

胃癌是我国高发恶性肿瘤之一，其发生发展是因为机体不能进行有效的免疫防御反应，致使肿瘤细胞逃逸机体免疫系统的监视和清除。恶性肿瘤患者免疫力低下，目前的主要治疗方法手术、放疗、化疗都会加重机体免疫功能的破坏，且对于晚期胃癌患者上诉疗法效果并不理想。放疗、化疗杀伤肿瘤，主要针对肿瘤异常的增殖能力，即使临床治愈，仍有大量肿瘤细胞残存。而细胞免疫治疗主要通过激活和强化机体免疫系统，利用抗原特异性细胞毒淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）对肿瘤细胞进行杀伤。因此，肿瘤细胞免疫治疗成为了副作用最小最有希望的治疗方法。

DC-CIK共培养时，DC分泌IL-2、IL-12、IFR-γ等细胞因子，可促进CIK增殖，显著提高CIK细胞的杀瘤活性。同时，DC表面的CD40和CIK表面的CD40配体结合，对肿瘤细胞的增殖产生负面影响。DC-CIK细胞治疗目前已经在血液系统肿瘤及实体瘤[5-6]治疗中均取得了良好效果，并且CIK细胞能够借助非特异性免疫杀伤作用对肿瘤患者体内的微小残余病灶进行清除[7]。CIK细胞主要通过NKG2D受体途径发挥溶细胞效应，清除恶性肿瘤患者残存的肿瘤细胞或肿瘤微病灶，可有效防止复发[8-9]。

多数学者认为恶性肿瘤患者体内DC缺乏，导致杀伤细胞的呈递作用减弱，进而造成CIK的杀伤活性减低[10-11]。因此，将DC与CIK细胞联合应用于恶性肿瘤的治疗，可增强机体杀灭肿瘤细胞的能力，构建高效稳定的免疫系统，缓解患者T细胞免疫功能低下的特点，有助于解除肿瘤患者的免疫无能，有研究发现化疗后给予免疫治疗有1+1＞2的疗效[12]。

机体的抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，体内抗肿瘤免疫主要由CD4+T细胞和CD8+细胞毒T细胞完成。CD4+CD8+细胞比值为中心的免疫调节，是机体免疫状态的中心环节。恶性肿瘤细胞产生的免疫抑制因子抑制淋巴细胞分化增殖，使CD4+/CD8+降低，机体免疫功能受损。本研究结果显示，观察组患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+细胞百分比、CD4+/CD8+细胞比值均有增高。说明CD-CIK细胞治疗能提高患者免疫功能状态，增加机体抗肿瘤免疫，且与化疗药物起到疗效协同作用，减少耐药的发生。2年的随访结果显示，观察组客观缓解率和疾病控制率均较对照组高，差异有统计学意义，提示DC-CIK联合化疗能提高晚期胃癌患者的生存率。

鲍峰等[13]回顾性研究了68例晚期胃癌患者于手术及放、化疗后静脉输注DC-CIK细胞治疗的疗效及不良反应，结果能显著改善患者生存质量，延长生存时间安全有效。杨涛等[14]通过DC-CIK联合治疗晚期实体瘤患者，42例可评价病灶，其中2例CR，9例PR，15例SD。要跟东等[15]使用DC-CIK细胞联合化疗对37例进展期胃癌患者治疗结果显示，所有患者CD4+、CD8+比率、NK细胞百分比等较治疗前均明显升高，且在改善患者生存率和复发率方面也有积极意义。本研究中1例发热，经对症治疗好转，目前有学者认为，生物治疗出现中度发热是机体免疫功能正常反应的结果，该反应对治疗有益。DC-CIK治疗安全性好，未发现严重不良反应。

本研究66例晚期胃癌患者经DC-CIK联合治疗后，临床症状明显缓解，延缓了疾病进程。但晚期患者肿瘤负荷过大，机体免疫抑制状态极大地限制了细胞免疫治疗疗效的显现，因此其应用时机及如何使其能更高提升机体免疫功能，规范融入肿瘤综合治疗，成为了一项有希望和富于挑战性的任务。随着现代分子生物学的发展，上诉问题会得到解决，细胞免疫生物治疗会成为一种重要的肿瘤治疗方法。

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistica,2010[J].CA Can⁃cer J Clin，2010,60:277-300.

[2]Roeenberg Sa，Restifo NP，Yang JC，et al.Adoptive cell transfer：a clinical path to effective cancer immunotherapy[J].Nat Rev Can⁃cer，2008,8（4）：299-308.

[3]严芳，张智，张珍，等.CIk细胞联合树突状细胞治疗恶性肿瘤的研究进展[J].临床医学工程，2010,17（9）：143-144.

[4]Sangiolo D.Cytokine induced killer cells as promising immunothera⁃py for solid tumors[J].J Cancer,2011,2(3):363-368.

[5]Li XD,Xu B,Wu J,et al.Review of Chinese clinical trials on CIK cell treatment for malignancies[J].Clin Transl Oncol,2012,14(2): 102-108.

[6]Mesiano G,Todorovic M,Gammaitoni L,et al.Cytokine-induced kill⁃er(CIK)cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumors[J].Expert Opin Biol Ther,2012,12(6): 673-684.

[7]郝希山.生物治疗肿瘤治疗的新希望 [J].中国医药生物技术, 2008,3(6):401.

[8]Rajbhandary S,Zhao MF,Zhao N,et al.Multiple cytotoxic factors in⁃volved in IL-21 enhanced antitumor function of CIK cells signaled through STAT-3 and STAT5b pathways[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(10):5825-5831.

[9]Yang B,Wang J,Cai LL,et al.Treatment of multiple solitary plasma⁃cytomas with cytokine-induced killer cells[J].Cytotherapy,2014,16 (2):278-284.

[10]Ma Y,Aymeric L,Locher C,et al.The dendritic cell-tum or cross-talk in cancer[J].Curr opin Immunol,2011,23(1):146-152.

[11]Devita V T,Rosenberg SA.Two hundred years of cancer research [J].N Engl J Med,2012,366(23):2207-2214.

[12]Zhou P,Liang P.Dong B,et al.Phase I clinical study of combina⁃tion therapy with microwave ablation and cellular immunotherapy in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Biol Ther,2011,11(5): 450-456.

[13]鲍峰，盛春华，杨光.DC-CIK细胞治疗中晚期恶性肿瘤531例分析[J].中国免疫学杂志，2011,27（4）：360-362.

[14]杨涛,邵江河.树突状细胞联合CIK细胞应用于晚期恶性实体瘤治疗的临床疗效观察[J].肿瘤,2010,30(8):700-705.

[15]要跟东，霍红旗，李鹏，等.进展期胃癌术后CIK细胞联合化疗的临床疗效评价[J].基础医学与临床，2011,31（4）：435-439.

（收稿：2015-08-06修回：2016-01-10）

（责任编辑李 勇）

Clinical Efficiency Observation of Dendritic Cells and Cytokine-induced Killer Cells Combination Therapy on Advanced Gastric Cancer Patients

LIU Xiao-ling，DONG Meng，TANG Yi-ling，et al.Department of Surgery I,Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Hebei Province,Cang⁃zhou（061001），China

ObjectiveTo investigate the safety and clinical effects of dendritic cells（DCs）co-cultured with cytokine-induced killer cells（CIK）combined with chemotherapy on patients with advanced gastric cancer. MethodsSixty-six patients with advanced gastric cancer were divided into two groups randomly，33 pa⁃tients in each group.The patients in the observation group were treated with DC-CIK after four cycle chemo⁃therapy,while the patients in the control group were treated with chemotherapy only.Tlymphocyte subtypes and serum tumor markers were compared between the two groups，The clinical effects were analysed and the safety was observed.ResultsThe ratios of CD3+,CD4+,CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood of the patients were increased after one month treatment（P＜0.05）.The serum tumor marker CEA was found（11.36±2.62）ng/ mL in the observation group,and（22.16±13.45）ng/mL in the control group after one month treatment.CEA in the observation group was decreased obviously as compared with the control group(P＜0.05).The objective re⁃sponse rate was 15.2%，and the disease control rate was 33.3%.ConclusionDC-CIK cells combined with chemotherapy can prolong the progression of advanced gastric cancer，by enhancing the autoimmune function, so as a safe and effective treatment.

Dendritic cells;cytokine-induced killer cells;chemotherapy;advanced gastric cancer

R735.2

A

1007-6948(2016)02-0124-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.02.005

河北省沧州中西医结合医院外一科（沧州 061001）

崔东晖,E-mail：lxl-1984-2@163.com