牛静秀，张利红，李佳丽，朱　慧，庞　雁，李维廉

树突状细胞疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗用于预防结直肠癌术后复发转移的临床疗效观察

牛静秀1，张利红2，李佳丽1，朱慧1，庞雁1，李维廉1

目的：评价树突状细胞(DC)疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)用于预防结直肠癌术后转移复发的临床疗效。方法：74例大肠癌术后患者分为两组，接受自体免疫细胞治疗设为I组（24例）；未接受自体免疫细胞治疗为NI组（50例）。记录I组患者迟发型过敏皮肤测试（DTH）和发热反应情况，并对两组患者接受治疗前后生活质量、无病生存期（DFS）进行对比分析。结果：24例I组患者中，DTH阳性为12/24（50.00%），发热反应为15/24（62.50%）；卡氏评分病人生存质量改善的在I组为8/24（33.33%）,相比较于NI组（19/50，18.00%）显著提高（χ2=7.063P=0.029）；Kaplan-Meier法生存期观察两组之间DFS，I组比NI组延长98 d（χ2=4.304P=0.038）结论：自体免疫细胞治疗早期结直肠癌,可以提高生存质量，延长复发时间。

结直肠癌；无病生存期；树突状细胞；细胞因子诱导杀伤细胞

结肠直肠癌（colorectal cancer,CRC）是世界上最常见的癌症之一，近年来呈不断上升趋势，手术，化疗，放疗为标准的临床治疗方法[1]。早期CRC患者中，术后进行辅助化疗和放疗是首选的治疗策略，然而，严重的治疗副作用及耐药常常导致治疗方案的中断。自体免疫细胞治疗是一种新兴的治疗方法[2-3]，因其毒副作用小，具有全身杀伤肿瘤细胞的作用而受到越来越多的肿瘤患者的青睐。树突状细胞(dendritic cell，DC)疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)方案是自体免疫细胞治疗的重要部分，治疗通过建立一个有效和特异性免疫反应，杀伤肿瘤细胞的同时最大限度地减少毒性，是预防复发和转移的最有效的手段[4]。

本研究采用回顾性分析的方法，观察其对患者生活质量、疾病预后及对以影像学表现确定患者无病生存率（disease-free survival,DFS）作为终点指标，评价DC-CIK治疗早期术后结直肠癌的临床疗效。

1　资料与方法

1.1一般资料从2012年1月1日—2014年1月1日期间在本院接受CRC根治性手术治疗的患者，建立病例档案，进行DFS的随访与研究。随访开始于术后3周。患者每半年做一次盆腔CT检查，第一次CT检查发现转移病灶被认为有肿瘤复发，该次CT检查距离手术的时间定义为DFS。74例CRC术后患者被纳入研究，男性47例，女性27例；平均年龄（62.88±11.04）岁（范围38～81岁）。原发肿瘤部位结肠27例和直肠47例。分化程度：高分化：14例，中分化38例，低分化22例。Dukes分期B期25例，C期49例。P＞0.05，随机分组均衡，两组间具有可比性(见表1)。

表1　病人的一般资料

1.2入组条件 （1）CRC手术患者，术后予辅助化疗的B期和C期患者。（2）心、肝、肾功能和骨髓造血系统及凝血系统功能基本正常。（3）年龄在18岁～90岁(含18，90岁)，男女不限。（4）既往未做过DC-CIK治疗。（5）病人愿意接受本方案治疗，自愿签署知情同意书，能按医嘱坚持用药，依从性好者，能接受医生的随访。

1.3试验方法

1.3.1分组方法本研究为临床回顾性对照队列研究。病例为我院同期住院的符合纳入标准的CRC术后病人，截止于2015年1月1日，共计复发74例，按照随访期间是否接受DC-CIK自体免疫细胞治疗分为实验组（I组）和对照组（NI组）。

I组：接受单纯自体免疫细胞治疗，入选病例总计24例。NI组：未接受自体免疫细胞治疗，入选病例总计50例。

1.3.2仪器和耗材B600-A型低速离心机，白洋离心机厂；高速冷冻离心机5810R，德国effendorf；血细胞分离机，德国Fresenius；CO2培养箱、离心机、生物安全柜、-80℃超低温冰箱，美国Thermo；生物倒置显微镜，德国leica。

1.3.3细胞制备[5-6]取大肠癌细胞系Sw480，经过机械分离得到的单细胞悬浮液，在心电图的监测下，在超声和离心（600 g，30 min）后，上清液用作致敏DCs和DTH测试。使用KABI系统获得单核细胞，并对去除白细胞的单细胞进行浓缩分离和培养。非贴壁细胞在添加有IFNγ、CD3单克隆抗体、IL-2、IL-1和自体血清的环境中连续培养10 d，形成CIK细胞。贴壁细胞在添加有GM-CSF、IL-4、肿瘤裂解液和TNF的环境中连续培养7 d，得到DC疫苗。细菌，真菌检测，内毒素检测合格后，备用。

1.3.4细胞治疗方案[7]采用DC-CIK联合自体免疫细胞治疗方案，详见表2。

1.4疗效评价指标

1.4.1迟发型过敏皮肤测试（delayed type hypersensitivity skin test,DTH）DTH是由致敏CD4 Th1和CD8CTL淋巴细胞介导的，表现为以单个核细胞浸润和细胞变性、坏死为特征的超敏反应性炎症。该反应发生迟缓，一般在接触抗原18～24 h后出现，48～72 h达高峰，是DC疫苗和联合CIK细胞治疗癌症患者的免疫反应临床指标。整个自体免疫细胞治疗完成1周后将结肠癌细胞系裂解物(40 μg/0.1 mL)于患者前臂皮下注射进行测试，观察24 h内患者皮丘清晰度直径。DTH的结果判断标准为：强阳性：48 h后＞10 mm；阳性：5～10 mm；弱阳性：2～5 mm；阴性：＜2 mm。

表2　细胞治疗方案

1.4.2发热反应治疗过程中发生的发热反应被分级详细记录。共分为四级：高热、中热、低热、不发热。

1.4.3生活质量(KPS分级)： 治疗过程中，KPS变化划分为三个等级：提高、稳定、恶化，划分标准如下：提高：治疗后比治疗前提高10分以上(包括10分)；稳定：治疗后比治疗前提高10分以下；恶化：治疗后比治疗前下降10分(包括10分)。

1.4.4生存期观察患者的DFS及不同时间复发转移率，并进行统计学分析。

1.5病人随访⑴对入组的CRC患者进行了无进展生存期的统计分析，随访开始于术后3周，2015年1月1日随访结束。每半年做一次盆腔CT检查，第一次CT检查发现转移病灶的被认为有肿瘤复发。⑵DFS定义为术后第一次CT检查发现转移病灶到手术日期的时间。⑶应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，使用Kaplan-Meier法估算DFS曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.6统计学方法自行编制EPIDATA数据库进行临床数据采集与记录，通过数据导出，与SPSS19.0软件对接，进行统计学处理，计量数据，t检验；计数数据，卡方检验；组间计量资料采用方差分析。

2　结果

2.1免疫反应(DTH结果)试验组DTH阴性率人数为12人，占总人数的50.00%，阳性人数为12人，占总人数的50.00%(见表3)。

表3 试验组DTH的结果（n=24）

2.2发热反应I组患者主要的不良反应为发热，高热4例，中热7例，低热4例，无发热：9例，发热比：62.50%。其中除1例外，发热患者以物理降温、口服解热镇痛类药物处理后，均可退热。1例高热患者，肌肉注射地塞米松后24 h内体温也可恢复至正常水平(见表4)。

表4　I组发热反应结果（n=24）

2.3生活质量KPS评分KPS评分I组和NI组分别在入组时和出组时按照KPS评分标准进行评分。I组与NI组组间比较：χ2=7.063，P=0.029，说明单纯自体免疫细胞治疗治疗KPS评分优于未进行肿瘤对症治疗的患者(见表5)。

表5　I组与NI组KPS评分比较

2.4生存期96例CRC患者术后CT随访，I组（298 d）与NI组（200 d）相比DFS延长98 d（χ2= 4.304,P=0.038）且具有统计学差异（见图1）。

3　讨论

随着细胞生物学、分子生物学、生物工程技术等专业的迅速发展，恶性肿瘤的免疫治疗迎来了新的转机。DC-CIK肿瘤免疫治疗在相关领域的地位与角色越来越受到重视。DC-CIK自体免疫细胞治疗是一种新兴的安全的治疗肿瘤的手段[8]。DC-CIK细胞疗法能激活病人自身的免疫系统从而对抗癌症、提高机体免疫能力、改善生活质量、延缓肿瘤复发和进展时间[9-10]。自体细胞免疫疗法，是一种个体化治疗方法，利用病人自身的抗肿瘤免疫细胞去杀伤肿瘤细胞。DC是一种起抗原呈递作用的免疫细胞，能激活CD4+辅助T淋巴细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞。以DC为基础的自体细胞免疫治疗方法，可以捕获、放大，并递呈肿瘤特异性抗原，产生具有杀伤肿瘤细胞能力的T淋巴细胞[11]。DC疫苗治疗作为肿瘤的主动免疫治疗方法，现已广泛地应用于多种恶性肿瘤的临床治疗。而CIK细胞是一类异质性细胞既表达T细胞免疫表型的CD3也表达NK细胞免疫表型的CD56，作为被动免疫治疗方法，CIK细胞在临床研究中表现出显著的细胞毒素活性，在DC诱导的抗肿瘤免疫中起到非常重要的作用。实际上，晚期肿瘤患者通常随着肿瘤的进展以及放化疗的的毒副作用的不断积累，病人的身体状况会不断恶化，单独的DC很难在病人身体中诱导出足够的杀伤性免疫细胞。

图5　I组比NI组DFS曲线比较

DTH是体内评价患者免疫功能的经典方法，该方法简单易行、花费少且效率高，现已成为评价自体免疫细胞治疗的公认方法[7]。DTH的阳性表明DC疫苗与CIK细胞回输到人体后激活了患者的免疫系统，24例早期大肠癌复发患者DC疫苗联合CIK细胞治疗在全部治疗结束后一周进行DTH皮肤测试显示，50.00%的患者可见在治疗中免疫反应被激活。随着机体免疫水平的提高，能带来机体对肿瘤细胞的有效杀伤，表现出病人的生活质量有所改善，本文结果显示74例病人中试验组I与对照组NI相比较，两组稳定或改善的人数比例分别为83.33%和70.00%，组间比较：χ2=7.063，P=0.029，P＜0.05，说明自体免疫细胞治疗组KPS评分优于未进行肿瘤对症治疗的患者。

DCs与CIK联合治疗癌症的最大的特点是在治疗过程中没有放疗或化疗中出现的骨髓抑制。恶心呕吐等严重副作用[12-13]。临床中以发热和皮疹较为多见，本试验中，24例患者治疗过程中均无皮疹现象出现，但发热率达62.50%。其中除1例外，发热患者以物理降温、口服解热镇痛类药物处理后，均可退热。1例高热患者，肌肉注射地塞米松后24 h内体温也可恢复至正常水平。因此，该治疗方案通常有着病人很好的配合度，展示了良好的临床应用价值[14-15]。

此外，大肠癌早期患者术后行DC-CIK自体免疫细胞治疗可延长复发周期，两组平均复发时间分别为298 d与200 d，试验组DFS延长98 d，组间比较，χ2=4.304，P=0.038，P＜0.05，且具有统计学差异。

综上所述，DC疫苗与CIK细胞注射到人体后，可以激活患者自身的免疫系统治疗肿瘤。自体免疫细胞治疗安全并有很好的患者依从性。本研究有待进一步扩增病例数，延长随访时间，力求大样本，多中心，国际化。

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（收稿：2014-12-20修回：2015-10-26）

（责任编辑张淑坤屈振亮）

Clinical Effects of Immunotherapy with Dendritic Cell Vaccine and Ctokine-induced Killer Cells in Pre⁃vention of Recurrence and Metastasis for post-Surgery Colorectal Cancer Patients

NIU Jing-xiu,ZHANG Lihong,LI Jia-li,et al.Tianjin Union Medicine Centre,Tianjin(300121),China

ObjectiveTo evaluate the clinical effects of immunotherapy with dendritic cells(DC)and cyto⁃kine-induced Killer(CIK)cells on prevention of recurrence and metastasis in post-surgery patients with colorec⁃tal cancer(CRC).MethodsA total of 74 post-surgery patients with CRC were randomly divided into two groups.24 cases who2=7.063P=0.029）.DFS in group I(298 days)was longer than DFS in group NI(200 days,χ2= 4.304P=0.038).ConclusionImmunotherapy with DC and CIK maybe improve QOL and prolong DFS in post-surgery CRC.

immunotherapy with DC and CIK were defined as group I,50 cases who did not

the immunotherapy were defined as group NI.Delayed type hypersensitivity(DTH)skin test results and fever were abserved in Group I.Quality of life(QOL)and disease-free survival(DFS)were analyzed in both groups.ResultsPositive rates of DTH and fever were 12/24（50.00%）and 8/24（33.33%）respectively in group I.Quality of life(QOL)by Karnofsky in group I was 8/24（33.33%）which was higher than that in group NI（19/ 50，18.00%,χ

Colorectal cancer；disease-free sur⁃vival；dendritic cells；cytokine-induced killer cells

R735.3

A

1007-6948(2016)02-0112-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.02.002

天津市科技计划项目（12ZCDZSY17100）

1.天津市人民医院肿瘤科（天津 300121）

2.南开大学医学院（天津 300073）

李维廉，E-mail:liweiliancn@126.com