吕春荣，王思宇，赵其毅，杨维林，邵庆勇，洪琼花

（1.云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224；2.云南省龙陵县畜牧工作站，龙陵 768300）

龙陵黄山羊成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

吕春荣1，王思宇1，赵其毅2，杨维林2，邵庆勇1，洪琼花1

（1.云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224；2.云南省龙陵县畜牧工作站，龙陵 768300）

实验采用龙陵黄山羊耳缘组织块贴壁培养法首次对龙陵黄山羊成纤维细胞进行体外培养，通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了龙陵黄山羊耳缘成纤维细胞系；并对其细胞形态、细胞活率、细胞核型等生物学特性进行了分析。结果表明：细胞倍增时间48 h，生长曲线为“S”型；染色体中正常二倍体染色体2n=60所占比例为91.68%。

龙陵黄山羊；成纤维细胞系；生物学特性

龙陵黄山羊为云南省的地方优良品种［1］，因其被毛黄色且产于龙陵县而得名。该品种具有适应性强、耐粗饲的特点，并以肉质细嫩、味美多汁、膻味小而著称［2］。龙陵县地处中缅边境。龙陵黄山羊是在特殊的地理环境下，经过长期的自然选择和人工选育形成的。该羊于1987年被列为云南省山羊保种品种之一，目前保种主要采取原产地活体保种的方式，保种方式单一、保种成本高，难以承担繁重的保种任务。而体细胞建系和冷冻保存技术是解决云南省地方家畜品种遗传资源保护的有力手段，它不但可以长时间保存优良家畜品种遗传资源，而且结合其他生物技术，如体细胞克隆或转基因技术，可以加快新品种培育速度，从而提高云南省家畜种质资源创新利用的技术水平。本研究针对此背景，以龙陵黄山羊这一省级保护动物的细胞为研究对象，利用动物细胞培养技术，从染色体水平、形态学水平进行了研究，并对遗传种质资源进行了保存。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料龙陵黄山羊耳样采自云南省保山市龙陵县乌木山良种繁育场，试验用耳样来源于1月龄龙陵黄山羊耳缘组织。

1.1.2主要试剂、仪器高糖DMEM、胎牛血清（FBS）由Gibco公司生产。青链霉素溶液和胰蛋白酶溶液购自Bioind公司；一次性塑料培养皿为Nunclon公司生产。

主要仪器设备：倒置相差显微镜（Olympus，Nikon）；CO2培养箱（Thermo）；透射电镜（JEM-1011）；实体显微（Olympus）；细胞计数仪；程序降温盒；液氮罐等。

1.2方法

1.2.1耳缘组织成纤维细胞原代培养选择健康的龙陵黄山羊耳缘组织刮净毛，用碘伏消毒后再用75%的酒精擦拭。用灭过菌的耳号钳取耳缘组织样本，75%酒精浸泡2min，再用生理盐水+1%青链霉素溶液冲洗3次，然后放入高糖DMEM+1%青链霉素溶液中，并放入4℃泡沫箱，24 h内带回实验室进行培养。在超净工作台上用柳叶刀刮去皮肤表面污物。用含1%青链霉素的PBS溶液冲洗4次，再用手术剪剪成碎块，放入直径50mm的培养皿中，每皿7～8块，缓慢加入少量培养液。培养液：高糖DMEM+10%FBS+1%青链霉素。最后放入培养箱（37℃，5%CO2，饱和湿度）中培养。每天在倒置相差显微镜下观察、照相、记录细胞迁移和增殖情况。

1.2.2成纤维细胞传代培养当成纤维细胞长至培养皿（瓶）底壁85%左右时，用PBS清洗3次，再用枪头吸净培养皿（瓶）里的PBS，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）37℃消化5min左右后，在倒置相差显微镜下观察，当细胞开始变圆并有少量细胞脱落时，加高糖DMEM+15% FBS液终止消化，吹打细胞使其完全脱落，以1∶2或1∶3比例进行传代培养。倒置相差显微镜下观察传代细胞生长增殖状况，并拍照。传代培养液与原代培养液相同。

1.2.3成纤维细胞冷冻与复苏细胞冷冻：0.125%胰酶（含0.01%EDTA）消化收集细胞，1 500 r/min离心5min，弃上清，用高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亚砜（DMSO）冻存液调整细胞浓度为1×107～3×107/mL，充分混匀，分装在冻存管中。冻存管上标明细胞名称、冻存管编号、性别和冻存日期。然后放入程序降温盒中，于-80℃冰箱过夜，次日投入液氮罐中长期保存［3］。

细胞复苏：从液氮中取出冻存管，迅速投入42℃水浴锅中，不停摇动使其受热均匀达1 min，转移至离心管中离心，弃上清，加入细胞培养液重悬细胞，移至培养皿（瓶）中，在（37℃，5%CO2，饱和湿度）的培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察复苏细胞生长状况，并拍照。

1.2.4成纤维细胞生长曲线测定取传至第2代、第4代、第6代的龙陵黄山羊成纤维细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/孔，接种于24孔培养板。从第2天开始到细胞长满，每天随机取3孔，连续7 d记数。用血球计数板在倒置相差显微镜下计数，取其平均值，以时间（d）为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.5成纤维细胞的核型检测取培养至汇合度为85%左右，并处于对数生长期的细胞为实验材料，参照Sun［4］方法进行染色体制备。

1.2.6细胞活率测定选取龙陵黄山羊第2、4、6代冻存前后的成纤维细胞，分别对细胞进行PI染色，在荧光显微镜下拍照，统计计算细胞存活率。

2　结果与分析

2.1龙陵黄山羊成纤维细胞形态学观察

耳缘组织块培养约5 d时，龙陵黄山羊成纤维细胞、少量类上皮细胞从组织块移出生长。随着培养时间的延长，大量成纤维细胞从组织块周围迁出并迅速增殖，成纤维细胞呈长梭形。当细胞长至培养皿（瓶）底壁85%左右时，进行传代培养。细胞进行传代培养后，生长速度加快，3～4 d细胞即可长满瓶底并再次传代。原代细胞及传代后细胞的培养结果见图1。

图1　龙陵黄山羊成纤维细胞

2.2龙陵黄山羊耳缘成纤维细胞冻存前及复苏后细胞活率

龙陵黄山羊成纤维细胞第2代、第4代、第6代冻存前活率分别为93.16%、92.58%、92.01%，复苏后活率分别为91.22%、91.06%、90.47%，细胞在冻存前和复苏后都有较高的存活率，均达90%以上，表明成纤维细胞培养条件适宜。另外，冻存对成纤维细胞存活率影响不大。

2.3龙陵黄山羊成纤维细胞生长的动态观察

根据每组每天测得的结果，绘制细胞生长曲线。如图2所示，各代细胞都经历了大约72 h的潜伏期，不同代次的细胞生长曲线均为“S”型。随着传代次数的增加，细胞增值速度有所变慢。

图2　龙陵黄山羊成纤维细胞生长曲线

2.4龙陵黄山羊成纤维细胞核型分析

参照Levan等［5］的标准，第3代细胞核型取100个分裂相进行统计分析。结果表明，龙陵黄山羊染色体数为2n=60的所占比例为91.68%，常染色体及X染色体均为端部着丝粒染色体，说明所培养的细胞遗传性能稳定，该细胞系为稳定的二倍体细胞系。

图3　龙陵黄山羊核型图（母）（1 000×）

3　讨论

进行细胞染色体核型分析时，当山羊的成纤维细胞用终浓度为0.1μg/mL时，秋水仙素处理时间为7～8 h、低渗时间为18～22min。在配制磷酸盐缓冲液时，用钠盐取代钾盐可以得到同样效果，同时降低了成本。据吴帅帅等［6］报道，云岭黑山羊的染色体数目2n=60；叶绍辉等［7］报道，龙陵黄山羊的染色体数目为2n=60。本实验结果表明，龙陵黄山羊的染色体数目为2n=60，与上述结论一致。

通过绘制龙陵黄山羊第2、4、6代细胞生长曲线，可以看出随着细胞传代次数的增加，细胞增殖速度有所减缓。此外，细胞解冻后活率也随着传代次数的增加有所降低。而本实验要求培养的细胞始终维持二倍体生物学性状，保持与体内细胞有较大相似性，因此不能传代太多，传6代细胞不用于实验就立即低温冻存。对第3代细胞中染色体众数进行检测，2n=60的占91.68%，染色体没有异常表现，说明该细胞系为稳定二倍体细胞系。

本研究建立的龙陵黄山羊耳缘组织成纤维细胞系增殖快，遗传性能稳定。此细胞系的建立，不但使龙陵黄山羊这一云南省优良遗传资源在细胞水平上得以保存下来，而且结合其他生物技术，如体细胞克隆或转基因技术，可以加快新品种培育速度，从而提高云南省家畜种质资源创新利用的技术水平，并为相关遗传学研究提供了有效的理论依据和理想的生物材料。同时对于开展其他动物成纤维细胞系的建立也有一定的理论和技术指导意义。

［1］云南家畜家禽品种志编委会.云南家畜家禽品种志［M］.昆明：云南科技出版社，1987：171-175.

［2］陈韬，彭和禄，谭丽勤，等.龙陵黄山羊屠宰性能及肉质研究［J］.云南农业大学学报，1996，11（3）：162-167.

［3］Ren FL，LiY，Zhang Y.In vitro cultivation and freezingofbovine skin fibroblastcells［J］.ScalperMagazine，2002，28：8-10.

［4］Sun Y L，Lin C S，Chou Y C.Establishment and characterization of a spontaneously immortalized porcinemammary epithelial cell line［J］. CellBiol Int，2006，30：970-976.

［5］Levan A，Fredga K，Sandberg A A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes［J］.Heredita，1964，52（2）：201-220．

［6］吴帅帅，吕春荣，权国波，等.云岭黑山羊成纤维细胞系建立及其生物学特性分析［J］.黑龙江动物繁殖，2013，21（4）：16-20.

［7］叶绍辉，彭和禄，林世英，等.云南龙陵黄山羊的核型及C-带和Ag—NORs研究［J］.云南农业大学学报，1996，11（2）：96-99.

Establishm entand the BiologicalCharacteristicsof Fibroblast Cell Line in Yunnan Longling Yellow Goat

LüChunrong，Wang Siyu，HongQionghua，etal
（Yunnan InstituteofAnimalScienceand Veterinary，Kunming650224，China）

In this study，the fibroblasts cell line derived from ear marginal tissue of Longling yellow goat was successfully established using the primary explants technique and cryopreservation technology.Themorphology，dynamic growth and karyotypes of the cells cultured after different passages were analyzed，the tissue cells of the ear were observed by transmission electronmicroscopy.The results showed that the population doubling time（PDT）of the cellswas 48 h；the growth curve of the cultured cellsappeared“S”shape；the frequencyofcellchromosomenumber tobe2n=60was91.68%.

Longlingyellow goat；fibroblastcell line；biologicalcharacteristics

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.06.003

S827.2

A

2095-3887（2016）06-0011-03

2016-09-11

云高新产业发展（201404）

吕春荣（1982-），女，助理研究员，硕士。

洪琼花（1968-），女，白族，研究员，硕士，主要从事绵羊、山羊的育种和高效繁殖新技术研究。