韩雪 李雯 李明锦 朱慧慧 刘会玲

·临床研究·

宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的表达

韩雪 李雯 李明锦 朱慧慧 刘会玲

目的：观察宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的表达。方法：选取甘肃省人民医院妇科2014年4月至2015年4月的宫颈癌术前患者22例，宫颈癌术后患者24例和健康者29例（对照组）。通过流式细胞仪检测患者外周血中的Treg细胞，通过对Treg细胞表面标记物CD4+、CD25+及转录因子Foxp3+的标记以及对宫颈癌患者外周血中Treg细胞的分布情况进行分析。结果：宫颈癌术前、宫颈癌术后及健康人患者血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比分别为(4.012±0.784)%、（1.915±0.508）%、(0.643±0.375)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增加可能影响机体对肿瘤的免疫效应，发生免疫逃逸而致瘤。

宫颈癌；Treg；免疫反应

宫颈癌是最常见的恶性肿瘤，其死亡率在妇科肿瘤中位居第二[1]。据世界卫生组织统计，2008年全球新增约50万宫颈癌病例，其中发展中国家约1.9%、发达国家约有0.9%的女性患宫颈癌[2]。Treg细胞被认为是一群具有抑制其他免疫细胞功能的负调控细胞，是恶性肿瘤及免疫疾病中外周免疫耐受的关键细胞，可以通过下调机体的免疫应答来降低宿主的抗肿瘤免疫反应[3]。本研究通过流式细胞仪对宫颈癌患者外周血中Treg细胞表面标记物CD4+、CD25+及转录因子Foxp3+的标记，来分析宫颈癌外周血中的Treg细胞的数量，探讨Treg细胞在宫颈癌患者外周血中的表达状态及临床意义，为宫颈癌免疫治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取宫颈癌术前患者22例，宫颈癌术后患者24例，所有病例均为甘肃省人民医院妇科住院病例，为2014年4月至2015年4月的新发病例。健康对照组29例，是甘肃省人民医院体检中心同期进行体检的健康志愿者。年龄35～65岁，平均年龄为50岁；三组人群中都征求了患者的同意，且近半年内未接受过任何免疫治疗，并排除自身免疫性疾病、严重的系统性、感染性疾病和妊娠等，三组患者之间资料差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组年龄比较

1.2 主要仪器与试剂批号为E10610-1635的anti-hu⁃manCD4FITC；批号为E10284-1633 的anti-humanCD25APC；批号为E09963-1633的anti-humanFoxp3PE）；批号为E00029-1671的Foxp3转录因子染色缓冲液；批号为4104911的FCM裂解液（用于裂解红细胞）；批号为4111109的流式细胞仪染色缓冲液。以上均购自杭州联科生物技术有限公司。流式细胞仪：BDFACSCal⁃ibur（美国BD公司）；12mm×75mm的圆底流式上样管、2ml 离心管；TGL-16 台式高速冷冻离心机；漩涡仪：GZ-Ⅰ多用振荡器（北京冰箱电机厂）；微量移液器（1000μl、100μl、10μl）；冰浴盒。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0软件分析和整理数据，CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的数量占所有外周血淋巴细胞的比例用（±s）表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

宫颈癌术前患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（4.012±0.784）%；宫颈癌术后患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（1.915±0.508）%；健康组外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（0.643±0.375）%，三组差异有统计学意义（P＜0.05）。CD4+/T细胞比例三组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1、图2。

表2 各组外周血CD4+/T细胞与CD4+CD25+Foxp3+/CD4+细胞比例

图1 流式细胞术检测外周血Treg细胞，LYM：淋巴细胞

图2 流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞

3 讨论

近年来，宫颈癌的发病率越来越高，预防和防治宫颈癌刻不容缓。目前临床上尚未尝试用细胞免疫治疗的方法来抑制肿瘤。许多小鼠肿瘤模型的研究证实，无论是在体内还是体外免疫，下调Treg细胞数目或抑制其功能有助于打破免疫抑制，促进CD8+T细胞杀灭肿瘤细胞[4]。

Treg细胞就是通常所称的CD4+CD25+Foxp3+的调节性T细胞，它有两种分化方式，一种是在外周，幼稚型Treg细胞受抗原刺激，由TGF-β诱导产生Foxp3，形成了CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。另一种是在胸腺，由未成熟的T淋巴细胞发育成熟，CD4+细胞通过Foxp3分化为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，称为自然产生的Treg细胞[5]。研究发现，Foxp3是CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的主要调控因子。Foxp3不仅对CD4+CD25+Treg细胞的活化有影响，而且对Treg细胞的发育和抑制也起一定作用[6,7]。Treg细胞可以通过多种途径来抑制机体免疫，例如：破坏细胞代谢、依赖抑制性、调节抗原呈递细胞功能、细胞因子以及溶解细胞途径[8]。Treg细胞还可以通过对机体免疫应答的抑制，使机体对肿瘤细胞产生免疫耐受。宫颈癌众多发病机制之一是癌细胞的免疫逃逸[9]。免疫逃逸可以使潜伏在机体内的HPV长时间不被发现，Treg细胞上调分泌免疫抑制因子TGF-β,IL-10、IL-35等，下调Th1、Th2细胞，抑制机体免疫[8]，此过程与Foxp3基因关系密切，Foxp3影响Treg细胞的发育和功能。研究表明，Treg细胞在宫颈癌患者中数量较多，Treg细胞数量与宫颈癌的分期及肿瘤大小密切相关，宫颈癌分期越高，肿瘤体积越大，Treg细胞的数量就越高[10]。

本研究通过流式细胞仪检测宫颈癌术前、宫颈癌术后及健康人患者血中的Treg细胞，发现Treg细胞在宫颈癌患者血中显著升高。通过对Treg细胞表面标记物CD4+、CD25+及转录因子Foxp3+的染色标记以及对宫颈癌患者外周血中Treg细胞的分布情况进行分析，结果显示，宫颈癌术前、宫颈癌术后及健康人患者血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比分别为(4.012± 0.784)%、（1.915±0.508）%和(0.643±0.375)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。由此说明CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增加可能影响机体对肿瘤的免疫监视，发生免疫逃逸而致肿瘤的发生。

综上所述，Treg细胞数量与宫颈癌患者病情进展程度、预后以及生存率有关。近几年研究也表明，免疫治疗可能成为抑制肿瘤进而治疗肿瘤的导向。因此，研究Treg数量在肿瘤性疾病中增高的原因、寻找抑制或清除Treg细胞的有效方法来降低Treg细胞数量，调节机体肿瘤微环境的变化，将为以后肿瘤性疾病的研究及自身免疫性疾病的治疗提供新的方向。

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A

1004-2725（2016）11-0822-03

甘肃省科技计划项目（项目编号：1105TCYA016）

730000甘肃 兰州，甘肃中医药大学临床医学院（韩雪、李雯、朱慧慧）；730000甘肃 兰州，甘肃省人民医院妇产科（刘会玲、李明锦）

刘会玲，E-mail:liuhuiling75@163.com