朱建凯，朱海燕，龙文娟

(青岛市精神卫生中心检验科，山东青岛 266034)



·临床研究·

小细胞肺癌患者血浆循环DNA定量检测和完整性分析

朱建凯，朱海燕，龙文娟

(青岛市精神卫生中心检验科，山东青岛 266034)

目的 定量检测小细胞肺癌患者血浆循环DNA并进行完整性分析。方法 收集60例肺癌患者(病例组)、40例健康者(对照组)样本，采用实时荧光定量PCR，以管家基因GAPDH为目的基因定量检测血浆DNA水平；以肌动蛋白基因β-actin为目的基因(长片段543bp，短片度230bp)分析完整性。应用SPSS19.0统计统计进行数据分析。结果 病例组患者血浆DNA水平[(3.105×105±0.923×105)copies/μL]高于对照组[(1.522×105±3.241×104)copies/μL]。病例组患者血浆DNA完整度指数(0.208 2±0.132 8)明显高于对照组(0.077 96±0.038 6)，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 小细胞肺癌患者血浆循环DNA水平和完整度均高于健康者。

癌,小细胞; 肺肿瘤；DNA/血液; 血液循环；DNA完整性

小细胞肺癌(SCLC)约占肺癌的20%，恶性程度高，转移早而广泛。目前用于检测和诊断SCLC的常见方法有影像学和肿瘤标志物如血清神经元特异烯醇化酶(NSE)、胃泌素释放肽前体(Pro-GRP)、细胞角质蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)和癌抗原242(CA242)等。循环DNA是存在于血浆等体液中的游离DNA，SCLC患者肿瘤组织可通过细胞坏死、凋亡等方式释放出，其水平与肿瘤进展、治疗及预后密切相关[1]。循环DNA的完整性为长片段与短片段DNA的比值[2]。本研究对SCLC患者循环DNA水平进行了检测，计算其完整度，旨在探讨循环DNA的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 60例肺癌患者(病例组)中男42例，女18例；年龄33～79岁，中位年龄58岁。另选择41例健康者作为对照组。所有血液标本均使用乙二胺四乙酸二钾真空采血管收集，取自患者术前。采血后3 500 r/min离心10 min分离血浆，取上清液，获得无血细胞成分的血浆，用1.5 mL离心管分装。

1.2 DNA抽提及检测[3]DNA抽提使用QIAamp DNABlood Mini Kit(Qiagen)试剂盒。循环DNA水平检测使用实时荧光定量PCR，以管家基因GAPDH为目的基因(表1)，引物序列参照相关文献设计。DNA样本与SYBR Green I 荧光染料以1∶100混合，使用ABI7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)定量检测，根据各自设定的临界值的循环数(Ct)值，计算循环DNA原始拷贝数，进一步分析实验室和对照组标本DNA水平。

1.3 DNA完整性分析 参照文献[4]，选用肌动蛋白基因β-actin为目的基因。设计引物扩增长片段543 bp，短片度230 bp。所有引物由上海生工生物工程公司合成。采用普通PCR仪扩增目的基因，反应条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。完整度计算为长片段与短片段PCR扩增产物比值。琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒DR01购自北京艾德莱生物科技有限公司。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR标本DNA纯度以A260/280值判断，病例组和对照组分别为1.81、1.85，可满足实验需要。扩增曲线和溶解曲线提示荧光定量PCR的实验条件良好。

表1 目的基因及引物序列

2.2 两组研究对象血浆循环DNA水平比较 病例组患者血浆DNA水平[(3.105×105±0.923×105)copies/μL]高于对照组水平[(1.522×105±3.241×104)copies/μL]，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 循环DNA完整度分析 以肌动蛋白基因β-actin为模板，病例组患者血浆DNA完整度指数(0.208 2±0.132 8)明显高于对照组(0.077 96±0.038 6)，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

循环DNA来源于细胞凋亡(正常人群，长度185～200bp)和细胞坏死(肿瘤患者，以长链DNA片段为主)[3，5-6]。肺癌在演化的不同阶段会伴随特定基因的改变，这些改变了的DNA片段会进入血循环中。有研究发现，血浆中游离DNA具有一定的肿瘤源性，因为其基因改变与肿瘤中的基因改变具有一致性。由于肿瘤患者细胞坏死所释放的游离DNA以长片段为主，其完整度高于健康者[7]。本研究60例小细胞肺癌患者血浆循环DNA水平和完整度均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，与已有研究结论一致[8]。由于血浆循环DNA水平很低，本研究进一步证实实时荧光定量PCR方法在灵敏度、重复性和准确度方面均能满足临床需要[9]。

值得注意的是，检测标本采用血浆而不是血清主要原因是血液凝固时白细胞破裂，释放DNA，不能完全反应循环DNA的真实水平。此外系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎[10]和白血病[4]、食管癌[11]等疾病时也会释放长片段DNA，因此，血浆游离DNA完整性对SCLC诊断的特异性不高。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.054

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1673-4130(2016)02-0262-02

2015-08-31