易 品 综述，邵超鹏，顾大勇，董瑞玲 审校

(1.南方医科大学生物技术学院，广东广州 510515；2.深圳国际旅行卫生保健中心，广东深圳 518033)



·综 述·

疟色素应用于拉曼光谱技术检测疟疾研究进展

易 品1综述，邵超鹏1，顾大勇2，董瑞玲2审校

(1.南方医科大学生物技术学院，广东广州 510515；2.深圳国际旅行卫生保健中心，广东深圳 518033)

光谱分析,拉曼； 疟疾; 实验室技术和方法; 疟色素； 特征峰

疟疾是一种由疟原虫感染引起的威胁生命的疾病，据世界卫生组织发布的最新情况，2013年仍有共计约1.98亿疟疾患者，其中58.4万人死亡。疟原虫侵入人体后早期寄生在肝细胞中，后期主要寄生在红细胞内。疟原虫在宿主红细胞内以血红蛋白中的珠蛋白部分为营养来源，而血红蛋白的血红素部分则被释放出来成为游离血红素，为避免游离血红素对疟原虫自身的杀伤作用，疟原虫将游离血红素转化成不可溶的高铁血红素结晶，即疟色素[1-2]。目前针对疟色素检测的研究取得许多进展，尤其是拉曼光谱技术。拉曼光谱技术的基本原理是利用激光照射介质后会产生与入射波长不同的光谱，从而获得分子振动的相关信息，进而获得物质的结构信息。疟色素具有特殊的二聚体分子结构[3]，拉曼激光照射疟色素会产生不同于血红蛋白的拉曼光谱,即特征峰，这为早期诊断疟疾带来希望。

1 拉曼光谱技术检测疟色素的优势

1.1 样本处理 拉曼光谱技术所需样品量非常少，样本无需进行染色或去除杂质等处理，液体、固体均可，甚至活细胞原位也能进行检测，而且检测后对样本无影响[4-5]，可避免常规检测手段样本处理过程中待检物的损失和待检物理化性质的改变。国内外学者将拉曼光谱技术应用于疟疾患者血清[5]、疟疾感染红细胞裂解液等的检测，通过分析拉曼光谱技术，可深入了解血清中疟色素是否存在，进而判断是否感染疟疾。此外活细胞原位拉曼光谱技术检测可以准确反应体内细胞和物质的实时信息如Frosch等[6]将显微共聚焦拉曼光谱技术应用于疟原虫感染红细胞原位检测，获得分辨率较高的疟色素在红细胞的分布图。在疟疾的检测方面，活细胞原位检测虽然直观高效但耗时长，而血清检测既简便、快速又准确。此外拉曼光谱技术具有无需标记且无波坏性的特点，对临床应用具有极重要的意义。

1.2 检测灵敏度 目前疟原虫感染的检测方法主要分为3种：(1)血涂片镜检，血涂片镜检仍然是目前临床疟疾诊断的“金标准”，虽然准确度高，但其有对检测者的要求高、耗时长和灵敏度差等缺点；(2)核酸检测，以PCR为代表的分子生物学技术检测疟原虫的特异性核苷酸片段来判断是否有疟原虫感染[7-8]，其灵敏度虽然有所提高(在疟原虫大于或等于5个/μL时其检测阳性率可达100%)，但对实验条件要求高且达不到快速检测的要求[9]；(3)抗原抗体反应，检测疟原虫的特异抗原如ELSIA、免疫胶体金技术等[9]，虽然具有操作简便、快速等特点，但灵敏度不高(阳性率为77%～98%，且是在疟原虫大于100个/μL条件下)[10]。总之，目前已有的检测手段存在灵敏度不够及实验条件要求高等缺点，而临床亟须一种灵敏度高又快速的检测手段。近年来随着拉曼光谱技术不断发展，市场上出现如显微共聚焦拉曼、激光共振拉曼、表面增强拉曼、便携式拉曼仪等新技术，这些新技术大大提高了拉曼光谱技术检测的灵敏度。显微共聚焦拉曼光谱仪测量样品可以小到1 μmoL的量，激光共振拉曼产生的信号强度可达到正常拉曼谱带的104～106倍，表面增强拉曼产生的拉曼信号较普通拉曼强104～107倍。便携式拉曼仪的应用使疟疾检测仪器小型化，便于开展疟疾的筛查。有文献报道，将疟原虫的检测浓度下限降低至5 nmol/L的极限(相当于每微升体积中含有30个早期疟原虫体)[11]，在活细胞原位检测时甚至可以达到纳米级的信号收集，扫描的分辨率达0.5 μm。

2 疟色素结构特性及拉曼光谱技术特点

2.1 疟色素结构及顺磁性 疟色素是由2个高铁原卟啉环[Fe(Ⅲ)PPIX]通过疏水键连接形成的二聚体结构[3,12]，见图1。在疟色素形成过程中血红素中的二价铁被氧化成三价铁，使原子轨道外周含有不成对电子，故使疟色素具有顺磁性。这种特性使疟色素在外加磁场作用下，产生磁力而被吸引，可用于与外周血中其他细胞或物质分离[13]。国外文献报道，基于外加磁场的疟原虫感染红细胞富集效果(富集效率为98%)优于密度梯度离心(富集效率为90%～97%)[14-15]，且具有磁性的表面增强其疟色素的拉曼增强效应明显强于无磁性的表面增强[16]。

图1 疟色素二聚体结构

2.2 疟色素的拉曼光谱技术特点 疟色素在拉曼光谱技术激光照射下会产生特异性拉曼光谱，且在不同波长(532、568、633、647、676、830、1 064 nm)下照射下会产生不同特征的拉曼光谱[17]，见图2，可能与不同波长激光照射时激光频率与分子内部相应分子键或结构共振有关。疟色素的拉曼光谱总结起来有以下几个特点：(1)在568、830 nm波长下，拉曼位移1 372 cm-1处拉曼强度明显强于其他几个波长，且疟色素拉曼位移在1 372 cm-1处峰强度较血红蛋白高，这与疟色素二聚体之间的四吡喏重叠区域共振有关，1 372 cm-1反映卟啉环反π*轨道电荷浓度相关[18]；(2)由于血红蛋白衍生物在400 nm附近均有强大的吸收带[邵氏带(Soret band)]的存在，在420 cm-1处附近有较强的峰，这与卟啉化合物结构有关，可依据此鉴定是否为卟啉化合物；(3)Q带，其在未插入金属离子时会出现4个峰，插入金属离子后减少到1～2个峰；(4)在532～647 nm波长中343、368 cm-1处峰强度随着波长增加而增强，且343 cm-1峰强度强于368 cm-1处。但当波长超过647 nm时343、368 cm-1处慢慢减弱，这与疟色素二聚体之间形成的丙酸酯键有关；(5)755 cm-1峰强度在633、647、676 nm波长激光检测时明显高于其他波长，755 cm-1反映卟啉呼吸环振动[19]；(6)1 623、1 568 cm-1除在568、830 nm波长处的强度稍弱外，其他波长下的强度均较强，这与吡咯环振动有关，1 623、1 568 cm-1不仅能反映铁离子的自旋状态，还能反映卟啉环中心孔径(core size,铁离子到吡喏氮离子的距离)的大小[20]。疟色素与血红蛋白的拉曼光谱比较见表1，疟色素的主要拉曼光谱特征峰见表2。

图2 不同波长下疟色素的拉曼光谱

血红蛋白(cm-1)感染红细胞中的疟色素(cm-1)疟色素(cm-1)16381638-16181619-16041604-15811578158115651563-15461545-14281427143013981396139813671366-13421343--1310130812491249-12261225-11721174-11291131-10901087-996998--972971-796797-757754

-：无数据。

表2 疟色素的特征峰[22]

注：此表根据平面对称卟啉系统评价，其中ν为伸缩振动，vinyl为乙烯基，δ为平面内变形振动，pyr为吡咯，deform为变形，sym为对称性，half-ring为半环；-无数据。

3 表面增强拉曼光谱技术在疟色素检测中的应用

拉曼光谱技术检测最大的缺点是拉曼散射信号弱，在疟原虫感染率极低的情况下，拉曼光谱技术检测可能出现假阴性，如果拉曼信号能被增强，将大大提高检出率。表面增强拉曼散射(SERS)的发现，使疟原虫的检测信号大大增强，可达普通拉曼的104～107倍。SERS定义为当物质分子吸附在一些特定粗糙的金属表面时分子的拉曼散射强度得到大大提升[23]，国外许多文献报道了SERS在拉曼光谱检测疟色素应用中的不错表现如2011年Yuen等[11]设计了一种以Fe3O4纳米颗粒为核心，以纳米银颗粒为包壳模式的表面增强，使得这种表面增强带有磁性富集作用，提升了检测灵敏度，达到5 nM的浓度极限(相当于每微升体积中含有30个早期疟原虫体)；2年后Yuen等[24]调整了Fe3O4纳米颗粒厚度及纳米银包壳大小，优化了以上表面增强，更进一步增强了拉曼信号；Garrett等[16]根据蝴蝶翅膀纳米结构设计了一种在以蝴蝶翅膀的纳米结构为基质表面镀纳米金的表面增强，这种增强能使检测极限达到虫血率为0.000 05%；Wood等[25]结合纳米探针技术与表面增强技术，设计了一种针尖增强拉曼散射(TERS)，克服了普通表面增强信号收集范围广所带来的信号干扰，实现了纳米级信号的收集，极大地提高了检测分辨率。新型材料石墨烯，具有理想的单层碳原子的二维结构，形成一个蜂窝状晶格平面，具有做表面增强的特性，最近研究表明，石墨烯具有明显的荧光猝灭现象，存在表面增强效应[26-27]。

4 疟色素应用于拉曼光谱技术检测疟疾的前景

拉曼光谱技术作为新兴手段应用于医学检测方面具有独特的优势，即高灵敏度、高分辨率、快速及标本无需处理等特点，近年来该技术逐渐成为生命科学领域的研究热点。拉曼光谱技术不仅用于血清、体液等的检测，还拓展到活细胞或组织原位研究如正常和感染疟疾的红细胞原位检测、血清中肿瘤标记物检测与定量分析、动脉粥样硬化的早期诊断等，这些研究均取得较好的结果。同时伴随着石墨烯表面增强纳米材料、表面增强、微流控等相关技术的发展，检测阈值和检测时间进一步缩小(或缩短)，这对早期诊断疟疾意义非凡。但石墨烯材料作为新发现的材料本身具有做表面增强基底的特性，其将具有巨大应用前景分子印迹技术结合表面增强将来会发挥巨大的应用潜力。拉曼光谱技术推广到临床使用还需要克服几个缺点如固体(或晶体)样品的检测效果优于液体、复杂样品的信号会受到干扰、检测范围小及自动化程度差等。相信在未来这些缺点会被一一克服，拉曼光谱技术凭借其检验特性将有望为医学检验学科的发展增添新动力。

[1]Egan TJ.Recent advances in understanding the mechanism of hemozoin (malaria pigment) formation[J].J Inorg Biochem，2008，102(5/6):1288-1299.

[2]Carter WD.Raman spectroscopic study of single red blood cells infected by the malaria parasite plasmodium falciparum[D].Orlando：the University of Central Florida，2007.

[3]Bonifacio A，Finaurini S，Krafft C，et al.Spatial distribution of heme species in erythrocytes infected with Plasmodium falciparum by use of resonance Raman imaging and multivariate analysis[J].Anal Bioanal Chem，2008，392(7/8):1277-1282.

[4]韦娜，冯叙桥，张孝芳，等.拉曼光谱及其检测时样品前处理的研究进展[J].光谱学与光谱分析，2013，33(3):694-698.

[5]Bilal M，Saleem M，Amanat ST，et al.Optical diagnosis of malaria infection in human plasma using Raman spectroscopy[J].J Biomed Opt，2015，20(1):17002.

[6]Frosch T，Koncarevic S，Zedler L，et al.In situ localization and structural analysis of the malaria pigment hemozoin[J].J Phys Chem B，2007，111(37):11047-11056.

[7]Ng J，Satkoski J，Premasuthan A，et al.A nuclear DNA-based species determination and DNA quantification assay for common poultry species[J].J Food Sci Technol，2014，51(12):4060-4065.

[8]Kain KC，Kyle DE，Wongsrichanalai C，et al.Qualitative and semiquantitative polymerase chain reaction to predict Plasmodium falciparum treatment failure[J].J Infect Dis，1994，170(6):1626-1630.

[9]Moody A.Rapid diagnostic tests for malaria parasites[J].Clin Microbiol Rev，2002，15(1):66-78.

[10]Srinivasan S，Moody AH，Chiodini PL.Comparison of blood-film microscopy,the OptiMAL dipstick,Rhodamine-123 fluorescence staining and PCR,for monitoring antimalarial treatment[J].Ann Trop Med Parasitol，2000，94(3):227-232.

[11]Yuen C，Liu Q.Magnetic field enriched surface enhanced resonance Raman spectroscopy for early malaria diagnosis[J].J Biomed Opt，2012，17(1):17005.

[12]董瑞玲，顾大勇，朱玉兰，等.拉曼光谱技术在疟疾检测中的应用[J].中国热带医学，2014，14(10):1270-1275.

[13]姚美雪，王恒.疟色素在疟原虫检测方面的应用研究进展[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2014，32(1):68-71.

[14]Trang DT，Huy NT，Kariu T，et al.One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells[J].Malar J，2004，3:7.

[15]Bhakdi SC，Ottinger A，Somsri S，et al.Optimized high gradient magnetic separation for isolation of Plasmodium-infected red blood cells[J].Malar J，2010，9:38.

[16]Garrett NL，Sekine R，Dixon MW，et al.Bio-sensing with butterfly wings:naturally occurring nano-structures for SERS-based malaria parasite detection[J].Phys Chem Chem Phys，2015，17(33):21164-21168.

[17]Frosch T，Koncarevic S，Becker K，et al.Morphology-sensitive Raman modes of the malaria pigment hemozoin[J].Analyst，2009，134(6):1126-1132.

[18]Wood BR，Caspers P，Puppels GJ，et al.Resonance Raman spectroscopy of red blood cells using near-infrared laser excitation[J].Anal Bioanal Chem，2007，387(5):1691-1703.

[19]贾文广，陈萍.拉曼光谱在红细胞及血红蛋白研究中的应用[J].内科，2007，2(2):249-251.

[20]Hirota S，Mizoguchi Y，Yamauchi O，et al.Observation of an isotope-sensitive low-frequency Raman band specific to metmyoglobin[J].J Biol Inorg Chem，2002，7(1/2):217-221.

[21]Wood BR，Langford SJ，Cooke BM，et al.Raman imaging of hemozoin within the food vacuole of Plasmodium falciparum trophozoites[J].FEBS Lett，2003，554(3):247-252.

[22]Drescher D，Buchner T，Mcnaughton D，et al.SERS reveals the specific interaction of silver and gold nanoparticles with hemoglobin and red blood cell components[J].Phys Chem Chem Phys，2013，15(15):5364-5373.

[23]周明辉，廖春艳，任兆玉，等.表面增强拉曼光谱生物成像技术及其应用[J].中国光学，2013，6(5):633-642.

[24]Yuen C，Liu Q.Optimization of Fe3O4@Ag nanoshells in magnetic field-enriched surface-enhanced resonance Raman scattering for malaria diagnosis[J].Analyst，2013，138(21):6494-6500.

[25]Wood BR，Bailo E，Khiavi MA，et al.Tip-enhanced Raman scattering (TERS) from hemozoin crystals within a sectioned erythrocyte[J].Nano Lett，2011，11(5):1868-1873.

[26]郭书鹏.石墨烯表面增强拉曼散射效应的探究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学，2013.

[27]刘智明，钟会清，倪艺榕，等.氧化石墨烯-金属纳米复合物的绿色制备及其SERS效应[G/OL].广东省光学学会2013年学术交流大会“暨”粤港台光学界产学研合作交流大会会议手册论文集,2013-12-13.[2015-4-30].http://kreader.cnki.net/Kreader/CatalogViewPage.

国家质检总局科研基金项目(2014IK054)。 作者简介：易品，男，在读硕士研究生，主要从事光谱学方法在疟疾的诊断中的应用及血液免疫分子生物学的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.035

A

1673-4130(2016)02-0229-04

2015-08-27)