高 漫，李 蒙，焦向阳

(陕西省结核病防治院，陕西西安 710100)



·临床研究·

结核分枝杆菌耐多药基因检测临床应用研究

高 漫，李 蒙，焦向阳

(陕西省结核病防治院，陕西西安 710100)

目的 评价耐多药基因检测利福平、异烟肼药物敏感性的可行性。方法 收集该院2014年6～12月94例结核病患者标本采用耐多药基因检测仪检测利福平、异烟肼药物敏感性并与BACTEC MGIT 960培养仪检测结果进行比较分析。结果 2种方法同时检测利福平、异烟肼药物敏感性符合率为91.5%(86/94)，符合率较高。结论 耐多药基因检测结核分枝杆菌药物敏感性灵敏度高，特异性强，对结核病患者的早期及菌阴患者的及时、有效治疗具有重要意义。

分枝杆菌,结核； 微生物敏感性试验； 基因,MDR； 实验室技术和方法

结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的严重危害人类健康的主要传染病，可累及全身各个脏器[1]。通过影像学检查与实验室涂片检查可快速诊断典型结核病，但对不典型病例影像学无法与其他疾病区分、涂片阴性的病例就依赖于各脏器受结核分枝杆菌感染后产生的痰液、胸腹腔积液、脑脊液、灌洗液、脓液等标本的结核分枝杆菌培养结果，这些标本成为检测结核分枝杆菌的主要对象，培养阳性就可诊断为结核病，结核分枝杆菌培养被视为诊断结核病的“金标准”[2]。但由于结核分枝杆菌生长周期长，就是用目前较先进的BACTEC MGIT 960培养仪进行培养，结核分枝杆菌培养阳性也需平均12 d时间[3]，进一步药敏试验还需平均9 d时间[4]。临床医生对该类病例只能通过经验用药，等待结核分枝杆菌药敏试验结果再调整用药，对患者的治疗具有一定影响。所以，一种快速、简便的药敏检测方法对于患者的早期及时治疗极为重要。耐多药基因检测操作简单、快速，可以在3 h内得出利福平、异烟肼的耐药结果[5]。本研究对耐多药基因检测方法进行了临床应用研究，旨在评价其临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院2014年6～12月住院结核病患者痰液、胸腹腔积液、脑脊液、灌洗液、脓液等经培养为结核分枝杆菌阳性标本94例作为研究组，以H37Rv(野生型)为阴性对照(对照组)，同时进行耐多药基因检测并与BACTEC MGIT 960培养仪检测结果进行比较分析。

1.2 仪器与试剂 耐多药基因检测仪由上海宏石医疗科技有限公司生产，试剂由厦门至善生物科技有限公司生产；BACTEC MGIT 960培养仪及试剂由美国BD公司生产。

1.3 耐多药基因检测方法 采用荧光PCR溶解曲线法。该法是在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后增加溶解曲线分析过程，同时实时监测荧光值变化，通过计算荧光值与温度的负导数获得探针与该序列杂交产物的溶解曲线并得出熔点(Tm值)，从而推测得到该序列突变信息。如靶序列与探针完全匹配则探针与该序列杂交的熔点最高；如探针与序列不完全匹配如序列发生点突变、插入或缺失则探针与该序列杂交的熔点低于探针与完全匹配序列杂交的熔点。熔点降低程度与点突变类型、插入或缺失碱基数量及突变位点位置有关。耐多药基因检测及BACTEC MGIT 960培养仪检测均严格按照标准操作规程进行。

1.4 统计学处理 计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组检测结果 阴性对照H37Rv(野生型)经耐多药基因检测与BACTEC MGIT 960培养仪检测异烟肼、利福平药物敏感性均为异烟肼、利福平敏感。

2.2 研究组检测结果 94例标本中耐多药基因检测利福平阴性率为80.9%(76/94)，阳性率为19.1%(18/94)；BACTEC MGIT 960培养仪检测利福平阴性率为84.0%(79/94)，阳性率为16.0%(15/94)。94例标本中耐多药基因检测异烟肼阴性率为83.0%(78/94)，阳性率为17.0%(16/94)；BACTEC MGIT 960培养仪检测异烟肼阴性率为76.6%(72/94)，阳性率为23.4%(22/94)。见表1。

表1 研究组检测结果(n=94)

2.3 2种方法符合率 对照组耐多药基因检测与BACTEC MGIT 960培养仪特异性与灵敏度相当，研究组94例标本中耐多药基因与BACTEC MGIT 960培养仪同时检测利福平、异烟肼结果相符86例，符合率为91.5%(86/94)，结果不符8例，不符率为8.5%(8/94)。

3 讨 论

利福平、异烟肼是抗结核的主要一线药，敏感与否直接影响结核病患者疗效。用BACTEC MGIT 960培养仪检测结核分枝杆菌药物敏感性前提是结核分枝杆菌培养阳性才能进行药敏试验，药敏试验还需平均9 d才能出结果，总共需23 d左右[6]，若患者送标本之前经抗结核治疗，体内结核分枝杆菌已死亡则BACTEC MGIT 960培养仪检测结果为阴性，不能进行药敏试验[7]。耐多药基因检测快速、简单，从分子生物学方面进行检测，对培养阳性或核酸提取阳性(对有生命力或无生命力的结核分枝杆菌核酸检测均为阳性)标本均可进行耐多药基因检测，仅需3 h即可检测出药物敏感性结果。

本研究结果显示，耐多药基因检测与BACTEC MGIT 960培养仪检测具有较好的一致性，符合率为91.5%(86/94)，在检测时间方面具有很大优势，仅需3 h即可检测出利福平、异烟肼药物敏感性结果，对结核病早期、菌阴结核病有效药物的选择具有重要意义。

作为一种实验方法，耐多药基因检测也有其局限性：(1)该实验只筛选核酸序列而不是氨基酸序列，因此，有可能不引起氨基酸改变的突变也会被判为突变；(2)耐药菌占总菌含量的40%以下可能会造成假阴性结果；(3)该产品从方法学上不能区分具体突变位点，因此，报告为突变的结果并不绝对表示耐药。但耐多药基因检测阳性率与BACTEC MGIT 960培养仪检测结果相当，价格相当，检测所需时间仅为3 h，临床可根据患者病情需要选择检测方法。

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[2]沈玉祯.结核病实验室诊断技术[J].齐齐哈尔医学院学报，2013，34(4)：563-565.

[3]梁亚萍，高漫.BACTEC MGIT 960用于结核分枝杆菌快速培养的初步评价[J].中国预防医学杂志，2011，12(6)：521-522.

[4]周昌明，罗丹，廖光付.结核分枝杆菌检测概述(综述)[J].中国城乡企业卫生，2009(4)：89-91.

[5]马艳艳，李辉，赵东阳，等.荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究[J].口岸卫生控制，2011，16(5)：21-24.

[6]马艳艳，李辉，钱成，等.结核杆菌基因型耐药检测研究[J].河南预防医学杂志，2010，21(5)：321-324.

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.041

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1673-4130(2016)02-0241-02

2015-07-02)