张 瑞

(延安大学附属医院，陕西延安 716000)



·临床研究·

实时荧光定量PCR在疑似肺外结核诊断中的应用价值

张 瑞

(延安大学附属医院，陕西延安 716000)

目的 探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测在疑似肺外结核诊断中的价值。方法 将怀疑有结核分枝杆菌感染的患者101例分为关节炎组(17例)、胸腹膜炎组(32例)、浅表淋巴结核组(20例)、肾结核组(13例)、其他结核组(19例)，分别取关节腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、浅表淋巴穿刺液、尿液等标本采用实时FQ-PCR进行结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)检测，同时进行抗酸杆菌涂片检测，对检测结果进行比较和统计分析。结果 101例疑似肺外结核患者关节穿刺液、胸腹腔穿刺液、浅表淋巴穿刺液、尿液、脑脊液等TB-DNA检测阳性率分别为41.18%、37.50%、50.00%、46.15%、35.87%；抗酸杆菌涂片检测阳性率分别为11.76%、9.38%、10.00%、7.69%、5.26%。抗酸杆菌涂片检测阴性标本采用实时FQ-PCR检测阳性率为35.87%，抗酸杆菌涂片检测阳性标本采用实时FQ-PCR检测全部为阳性。结论 实时FQ-PCRR在疑似肺外结核诊断中具有重要价值。

聚合酶链反应； 荧光光度测定法； 肺外结核； 诊断价值

我国人口众多，肺结核患者人数巨大[1]。与此同时肺外结核发病率也呈逐年上升趋势，结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、结核性关节炎、淋巴结核、肾结核患者数量增多。肺外结核由于较为隐匿而较难发现，因此，临床诊断难度较大，一直以来均是困扰临床医生的问题，传统方法检出率低，检测周期过长导致临床漏诊时有发生，严重影响患者预后[2]。近年来随着实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术的应用，肺外结核检出率较以前有了较大提高[3]。本研究对住院的101例肺外结核患者TB-DNA检验结果和抗酸杆菌涂片检测结果进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012～2014在本院住院的疑似肺外结核患者101例，其中男67例，女34例；年龄11～84岁，中位年数49岁。分为关节炎组(17例)、胸腹膜炎组(32例)、浅表淋巴结核组(20例)、肾结核组(13例)、其他结核组(19例)。

1.2 标本来源 临床医生在无菌条件下分别抽取关节腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、浅表淋巴穿刺液及留取中段尿液5 mL并将标本置于无菌瓶中立即送检。

1.3 试剂 抗酸杆菌涂片检测染色液为珠海贝索生物技术有限公司提供，结核分枝杆菌DNA检测试剂、质控品、标液均为中山大学达安基因公司提供。

1.4 检测方法 对采集的标本分别采用实时FQ-PCR检测TB-DNA和抗酸杆菌涂片检测抗酸杆菌。

1.4.1 实时FQ-PCR 分别取无菌留取的穿刺液和尿液各1 mL，加入1.5 mL离心管中12 000 r/min离心5 min，留取沉淀，加入1 mL无菌生理盐水洗涤2次，离心留取沉淀并加入50 μL DNA提取液充分混匀，在100 ℃恒温干浴10 min后冷却并12 000 r/min离心5 min待用。阴、阳性质控品按操作规程进行处理。将处理过的标本，标准品，阴、阳性质控品分别吸取上清液脑脊液、2 μL加入反应管中，瞬时离心5 s，按预设程序进行扩增和分析。

1.4.2 抗酸杆菌涂片 分别取无菌留取的穿刺液和尿液各1 mL，3 000 r/min离心15 min，弃上清液，留沉渣涂片，固定，抗酸染色，镜检。

1.5 统计学处理 应用SPASS13.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组患者抗酸杆菌涂片和实时FQ-PCR检测结果比较 各组抗酸杆菌涂片检测阳性率均明显低于实时FQ-PCR，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 各组患者抗酸杆菌涂片和实时FQ-PCR检测结果比较

*：P<0.05，与同组抗酸杆菌涂片比较。

表2 抗酸杆菌涂片与实时FQ-PCR阳性率比较

*：P<0.01，与抗酸杆菌涂片比较。

2.2 2种方法检测阳性率评价 抗酸杆菌涂片检测阳性标本采用实时FQ-PCR检测全部为阳性，而抗酸杆菌涂片检测阴性的92例标本采用实时FQ-PCR检测阳性33例，阳性率为35.87%。

3 讨 论

随着社会的发展，人们的生活方式发生了多样化改变，作息时间不规律，环境污染等外加因素的存在导致肺结核感染的发生过来越多。与此同时肺外结核发生率也呈逐年上升趋势，由于肺外结核较为隐匿而难发现，一直以来均是困扰临床医生的问题，传统检测方法虽然简便、快速、价廉，但灵敏度低，特异性差，且不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌感染，尤其是不能检出L型和颗粒型结核分枝杆菌[4-5]。培养法是诊断结核病的“金标准”，精确可靠，特异性高。但其所需时间达4～8周，严重影响了结核病的早期诊断和及时治疗。近年来随着实时FQ-PCR技术的发展和在临床的广泛应用，肺外结核检测阳性率明显提高[6]。实时FQ-PCR由于是在常规PCR的基础上加了荧光标记的探针，将核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起，实现了对目的基因的准确定量。该法特异性也较传统检测方法高，已得到临床的一致认可[7-9]。

本研究通过对101例疑似肺外结核患者关节腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、浅表淋巴穿刺液及尿液等标本进行TB-DNA检测结果显示，关节炎组、胸腹膜炎组、浅表淋巴结核组、肾结核组、其他结核组TB-DNA阳性率分别为41.18%、37.50%、50.00%、46.15%、36.84%；而抗酸杆菌涂片检测阳性率分别为11.76%、9.38%、10.00%、7.69%、5.26%；实时FQ-PCR检测阳性率明显高于抗酸杆菌涂片，差异均有统计学意义(P<0.05)。抗酸杆菌涂片检测101例标本阳性率为8.91%，而实时FQ-PCR检测TB-DNA阳性率达41.58%。二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

本研究对抗酸杆菌涂片检测阴性的标本采用实时FQ-PCR检测TB-DNA阳性率为35.87%，由此发现，抗酸杆菌涂片检测的漏检率较高，对患者临床诊断影响很大，而抗酸杆菌涂片检测阳性标本采用实时FQ-PCR检测均为阳性。

本研究结果表明，采用实时FQ-PCR检测患者关节腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、浅表淋巴穿刺液及尿液诊断肺外结核具有灵敏度高、特异性强等特点，可作为临床诊断肺外结核可靠的实验方法，可广泛应用于临床检测。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.040

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1673-4130(2016)02-0239-03

2014-11-17)