刘华威, 罗来鑫, 朱春雨, 梁超琼, 刘鹏飞, 李健强*

(1.中国农业大学植物病理学系, 种子病害检验与防控北京市重点实验室, 北京 100193; 2. 种苗健康北京市工程研究中心, 农业部植物病理学重点实验室, 北京 100193; 3. 农业部农药检定所, 北京 100026)



黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治研究进展

刘华威1,2, 罗来鑫1,2, 朱春雨3, 梁超琼1,2, 刘鹏飞1,2, 李健强1,2*

(1.中国农业大学植物病理学系, 种子病害检验与防控北京市重点实验室, 北京 100193; 2. 种苗健康北京市工程研究中心, 农业部植物病理学重点实验室, 北京 100193; 3. 农业部农药检定所, 北京 100026)

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)主要危害葫芦科作物,已被世界上许多国家和地区列为检疫性有害生物。CGMMV目前在我国23个省、市、区已有报道发生和危害,严重影响葫芦科作物的生产;近年来该病害在国内外呈现迅猛扩展的趋势并对生产造成危害。本文综述了防治该病害的种子处理、化学及生物防治、嫁接以及转基因等分子生物学方法;分析了CGMMV与寄主黄瓜互作研究的最新进展,对小分子RNA参与调控寄主对CGMMV病毒的防控策略提出了展望,并概述了下一代测序技术、基因编辑技术在植物新病毒的检测、鉴定以及培育抗病新品种等方面的应用。

黄瓜绿斑驳花叶病毒; 防治方法; 研究进展

中国是世界上最大的蔬菜生产国,其中2013年的黄瓜产量为5 431.59万t,占世界总产量的76%[1]。黄瓜作为重要的蔬菜之一,提高其产量和生产效益一直受到世界各国研究人员的重视。近年来,随着黄瓜栽培面积的增加和栽培品种的多样化,黄瓜上病害种类也随之增加,其中黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus, CGMMV)由于传播迅速且目前无法彻底根除,已逐渐成为严重危害葫芦科作物生产的病毒病害之一。目前,物理方法、化学药剂、生物防治、农事操作以及生物学技术已被广泛用于防治CGMMV,并取得了一定的防治效果。2014年,农业部颁布了该病毒病的防控技术规程[2]。但由于CGMMV在种子等传播材料中存在方式的隐秘性、持久性,以及其传播途径的多样性,使得如何有效防治黄瓜绿斑驳病毒、探索合理而稳定的防治措施来控制该病害成为各国农业研究人员亟待解决的问题。

1 CGMMV病原生物学研究

CGMMV属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员,为正单链线状RNA病毒,粒子大小约为18 nm×300 nm的螺旋状结构,每3周含有49个亚基,螺距2.3 nm。位于核中心的RNA基因组长度6.4 kb左右[3],其编码的17.3、29、129、186 kDa 4个蛋白,分别与CGMMV在寄主植株体内的复制、移动相关[4]。另外,基因组5′和3′端分别含有帽子结构和poly(A)尾巴及类似tRNA的结构。5′端的帽子结构可提高mRNA的稳定性及增加翻译效率,并保护RNA不受降解[5]。而3′端结构可提供复制酶、核糖核酸结合蛋白识别和结合的位点,与寄主细胞蛋白进行竞争性结合[6]。研究表明,CGMMV的钝化温度在90～100℃之间,稀释限点为10-6～10-7,病毒粒子在-20℃下仍可以存活[3]。

CGMMV自1935年首次被报道以来[7],目前在亚洲[8-18]、欧洲[19-29]、南美洲[30]、北美洲[31-32]和大洋洲[33]均有发生且造成不同程度的危害(表1),其中在中国境内的23个省、市、自治区报道有发生且造成危害(表2)[10, 34-52]。CGMMV主要寄生于葫芦科作物,如:黄瓜(Cucumissativus)、西瓜(Citrulluslanatus)、甜瓜(Cucumismelo)等,另外也可侵染苋色藜(Chenopodiumamaranticolour)、曼陀罗(Daturastramonium)、菟丝子(Cuscutachinensis)、本生烟(Nicotianabenthamiana)和珊西烟(Nicotianatabacum)等[3]。已有研究表明,CGMMV是典型的种传病毒,主要寄生于种子的胚。根据对感病西瓜种子不同部位的检测,其结果显示子叶、外种皮以及内种皮均被侵染,且其对应部位带毒量依次降低[53]。CGMMV侵染黄瓜后,病毒粒子可通过韧皮部对黄瓜植株体进行系统性侵染[54]。因此,禁止感染CGMMV的带毒种子在不同种植区运输是控制该病害长距离传播的关键[55]。另外,农事操作,如嫁接、汁液接触、人工授粉、土壤带毒、灌溉水以及菟丝子等也可造成CGMMV直接或间接地传播[3, 56-57]。随着检测技术的发展,包括生物学、血清学和电镜技术等已广泛应用于CGMMV检测中,尤其是RT-PCR方法及其衍生技术包括荧光RT-PCR法、免疫捕获RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR方法均成熟应用于CGMMV的检测,并可成功检测到黄瓜种子中含量为2 ng的CGMMV病毒粒子[58]。鉴于当前的防治措施对处理存在于各种传播材料中的CGMMV仍留有死角、并不足以彻底截止其传播。因此在生产中除了将各种手段应用于CGMMV的检测、尽量降低其传播的风险外[59],研究具有实效的防治措施、杜绝CGMMV的发生与传播,是病害管理的重中之重,亦可以间接减少种植者的投入并增加收益。

表1 黄瓜绿斑驳花叶病毒病在世界范围内的发生与危害

表2 黄瓜绿斑驳花叶病毒病在中国范围内的发生与危害

2 CGMMV侵染症状及危害

CGMMV侵染寄主后,造成植物组织内的酚类物质、碳水化合物浓度降低,叶绿体数量及叶绿素含量减少[60]。寄主叶部、果实表面通常会产生花叶、斑驳症状,随着病情的发展进一步形成浓绿色的褪绿斑或突起。严重时,造成植株矮化、开花延时,并最终导致作物减产至绝收。同时,西瓜被侵染后,感病植株的果实会形成瓤状空洞、种子周围的果肉呈纤维状而失去食用价值[3]。

CGMMV的侵染对作物生产造成了巨大的经济损失。1968年日本关东地区西瓜由于CGMMV的侵染危害,造成约9亿日元的损失[8];1969年Fletcher报道英格兰Lea Valley地区的黄瓜由于早期受到CGMMV侵染产量损失15%, 但后期侵染对产量影响不大[19];1978年印度德里地区甜瓜的受侵染率为70%～80%[9];1998年韩国被侵染作物达到463 hm2[11];2004年巴基斯坦部分地区葫芦作物CGMMV发病率达46.9%[12]。2005年中国辽宁盖州由于种子带毒而导致大面积西瓜感染CGMMV,失去食用价值[10]。2011-2013年中国山东、江苏、浙江均有报道CGMMV在西瓜上大面积发生[36-37, 39]。

3 CGMMV防治措施

根据以往研究报道,目前已有包括种子处理、化学防治、生物防治、嫁接以及分子育种技术等在内的多种方法和手段被实际应用于防治CGMMV。

3.1 种子处理

Kim报道,通过75℃处理72 h的方法,可以使种子中的CGMMV彻底失活, 而85℃处理24 h的种子仍存在45.8%的带毒率[61]。随后,他又通过电镜观察和RT-PCR的方法得知CGMMV基因组对温度的敏感区域位于2～2.5 kb和4～4.8 kb,该区域易受温度破坏而造成CGMMV失活[62]。然而,由于CGMMV寄藏部位的特殊性以及种壳的保护,Reingold发现温度(72℃处理72 h)处理、磷酸三钠(10%)处理,或者同时采用两种方法处理种子后,结合ELISA和PCR检测,结果显示种子仍可能带有病毒,这些处理措施效率不高且不稳定[63]。

3.2 化学防治

目前,实际生产中已开发出对多种作物病毒病有防治效果的化学制剂,其抗性机制主要是钝化病毒外壳蛋白,影响病毒在寄主体内的定殖或诱导寄主产生抗病性,尽管已进行商业化生产、用于防治作物病毒病的药物已有170个,但是却仍未有针对CGMMV有防治效果的药剂被开发出来(表 3)。其中,盐酸吗啉胍(moroxydine hydrochloride)作为最重要、最常用的化学成分之一,可以经植物气孔进入植物体内活细胞中,通过抑制或破坏核酸和外壳蛋白的形成,阻止病毒在植株体内的复制,从而达到防治病毒病的目的[64]。盐酸吗啉胍除了单独使用外(占防治作物病毒病害药剂的10.28%),也可与乙酸铜复配使用,目前已成为防治作物病毒病害的主要药剂(占防治作物病毒病害药剂的40%)。另一种被广泛应用的药剂是氨基寡糖素,它参与调节植物生长、发育的分子信号[65],并被证实有增强植物抗病能力的作用[66]。香菇多糖从藻类掌状海带(Laminariadigitata)中提取、纯化得到,作为一个非特异性的激发子,通过预处理植物而引起寄主体内PR蛋白积累、调节寄主免疫功能、刺激植物自身产生干扰素,从而使得寄主对病原微生物产生抗性[67-68]。混合脂肪酸可通过诱导寄主体内的抗病基因表达、提高病原相关蛋白、酶和细胞分裂素等含量,从而使得植物产生抗病能力[69]。

表3 我国目前应用于蔬菜和作物病毒病害防治的登记药剂目录

3.3 生物防治

在CGMMV的生物防治策略中,Verma发现狭叶钩粉草(Pseuderanthemumbicolor)叶子的提取物含有内吸性的抗性诱导因子(systemic resistance inducer,SRIs),在温室条件下,通过喷洒其提取物,可以提高黄瓜植株对CGMMV的抗病性[64]。随后,Tewari采用13种蕨类植物提取物进行防治CGMMV的试验,结果发现Adiantumcaudatum,Dryopterisfilix-mas和Polypodiumparasiticum的提取物可有效抑制CGMMV在寄主体内的复制[69]。最近,Ali利用弱毒株系CGMMV-SH33b预接种的方式开发出一种保护香瓜免受野生CGMMV进一步侵染的防治方法[70-71]。另外,嫁接技术一直以来是葫芦科作物在生产中普遍应用的农事操作技术,也是防治病虫害的有力措施之一[72-73]。然而,赵慧茹试验证明CGMMV可从西瓜砧木中运输到其接穗中,从而使得CGMMV通过嫁接传播而潜在地成为田间的初侵染来源[49]。

3.4 抗病分子育种防治

由于CGMMV传播途径的多样性,已采取的防治措施仍不足以彻底杜绝CGMMV的传播,或者防治效率不高需要投入较多的防治费用，因此,培育抗病性强、抗性稳定的新品种是大势所趋,而基于分子水平的抗病育种成为相对稳定、长期、经济的有效策略。目前, 已尝试在一些重要的经济作物上培育转基因抗病性植株,尽管不同寄主的抗性信号以及病原侵染机制存在多样性和复杂性,但基于内源基因和外源基因介导培育抗性植株仍是常用的途径之一[74]。Rajamony通过对大量不同香瓜品种的抗病性测定,成功地筛选到7个抗CGMMV的香瓜野生品种,并进一步通过嫁接、杂交等手段将抗性基因转移到其他葫芦科栽培品种上,以此达到抗病、防病目的[75],而基于转基因途径防治CGMMV技术的应用则进一步拓展了对该病害的防治方法。1986年Abel试验验证了烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)外壳蛋白介导植株的抗性,结果表明由于外壳蛋白的介导作用,接种TMV的转基因烟草植株发病时间延迟,且10%～60%接种植株上没有产生症状[76]。随后,Provvidenti发现由外壳蛋白介导产生的抗性在南瓜植株中也存在一定的广谱性和遗传性[77]。在已有的研究基础上,De发表了由CGMMV复制酶基因介导产生抗性植株的专利方法[78];Park克隆了CGMMV外壳蛋白、并通过重组载体获得了抗CGMMV的西瓜植株,并且在获得的140株第一代转基因植株中有10株具有抗性[79];2012年Ali克隆CGMMV移动蛋白后,通过基因重组和农杆菌介导的方法获得抗CGMMV的甜瓜植株,进一步由PCR和Southern blot的方法证明移动蛋白基因可稳定遗传至第三代植株体内[80]。然而,植物病毒在自然条件下通常都是以复合侵染的形式存在[81],而基于外源基因产生的抗性植株往往存在抗病谱窄、仅抵抗同种病毒侵染等缺陷。因此,在田间条件下,随着转基因植株抗性压力的不断选择和抗性的丧失,亟须培育多病毒基因片段介导的抗性植株[82-83]。2013年Lin通过农杆菌介导,将融合了西瓜银斑病毒(Watermelonsilvermottlevirus,WSMoV)N基因和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)和CGMMV的外壳蛋白基因的重组载体转入西瓜栽培种‘Feeling’,并由Southern blot证明单个或多个基因拷贝被成功插入到西瓜基因组中,且在R0植株中存在对CGMMV的抗性[84]。Liu利用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术在感染CGMMV的黄瓜植株体内成功鉴定到38个差异表达蛋白, GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析发现这些蛋白注释有不同的功能,其中18个蛋白分别参与13个代谢通路中,这些代谢通路进一步可融合形成3个相对独立的网络关系调控图,从而根据其相互调控关系,有目的地筛选合适的内源病程相关基因来培育抗病植株防治CGMMV病害[85]。

4 防治策略展望

结合该病害的当前防治现状,作者对基于小分子RNA介导寄主抗病的途径进行了展望,并介绍了下一代测序技术、基因编辑技术在植物病毒病害防治措施中的应用。

4.1 小RNA介导调控防治CGMMV

RNA沉默是真核生物通过核酸序列特异性的相互作用、在RNA水平抑制基因表达、抵抗外来核酸入侵的一种防御机制,这种机制被称之为转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS)[86]。

1928年Wingard记录了感染烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus)的烟草植株呈现坏死斑症状,而其上部新叶在第二次接种后对该病毒侵染呈免疫现象、且无坏死斑产生,从而开始最早的RNA沉默(RNA silencing)报道[87]。近年来,由siRNA(small interfering RNA)和miRNA(microRNA)介导调控的RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)已经成为改善作物生产的重要途径。基于siRNA的RNAi技术已被广泛应用于作物增产,增强对细菌、真菌、病毒、线虫等有害微生物的抗性,以及改善作物的营养成分组成[88]。2007年,Kamachi发现获得的7株转CGMMV外壳蛋白拟南芥植株中的5株对CGMMV产生高抗,植株接种后无系统扩展症状,RNA杂交表明转基因植株体内含有CP的特异干扰RNA,对CGMMV的复制具有较高的抑制率并对CGMMV的侵染有较强抗性,其抗性可稳定遗传至T2代[89]。但siRNA介导的转基因植株易受寄主、环境影响以及存在外源基因与寄主基因组易发生重组等潜在风险。相对于siRNA的RNAi策略,由于miRNA具有更高的特异性和更可观的预见性,以及其在调节植株生长、发育和应答外界压力时的优异表现而日益受到重视[90]。尤其最近几年,由于作物品种差异以及外界不同因子对寄主造成的压力因素,大量的miRNA得到鉴定并挖掘出其调控的靶基因,为进一步研究miRNA所调控的,远比自身数量更多的靶基因与生物物种或生物学多样性之间的关联性奠定基础[91]。2011年,Martínez利用深度测序技术在感染啤酒花类病毒(Hopstuntviroid, HSVd)的黄瓜(Cucumissativus)植株内获得19个保守的miRNAs和7个新的特异性miRNAs,并通过Northern杂交进一步得到验证,其所调控的靶基因分别参与寄主蛋白-蛋白/RNA互作、组织发育、调节次生代谢等生物过程[92]。Mao结合高通量测序和降解组测序的方法从黄瓜(C.sativus‘Jinchun No.2’)叶和根组织中鉴定出64个miRNA,发现部分miRNA只在特定组织中表达。其中, 21个首次在黄瓜中鉴定到的已知miRNA调控的靶基因分别参与黄瓜发育、抗氧化、信号转导、转录调控等功能[93]。Li通过黄瓜(Cucumissativus‘9930’)和南瓜(C.moschata‘Jinxin No.5’)之间的嫁接,在其叶和根部组织中鉴定出112个已知的和48个新的miRNAs,并由生物学分析明确嫁接操作可直接导致miRNA及其靶基因的表达变化,反之,也间接证明miRNA可以通过介导靶基因而显著影响嫁接苗的生理过程[94]。Liu从感染CGMMV的黄瓜植株(C.sativus‘中农16’)体内获得8个新的miRNA,其调控的多个靶基因分别参与黄瓜的细胞分化、生长发育、次级代谢、生物或非生物应答、光合作用以及作物产量相关的生物过程[95]。鉴于miRNA在植物的抗逆生理和生长发育过程中出众的调控能力,尤其在基因调控网络关键点所起的作用,以及所调控靶基因之间的相互关系,极其有助于在基因转录水平挖掘更多的病程相关基因,从而使得利用miRNA介导的转基因植株或利用其所调控的病程相关基因培育抗病品种的研究具有较大的发展潜力[90]。

4.2 下一代测序技术和基因编辑技术在防治CGMMV中的应用

在实际生产中,防治病害的前提是准确发现、鉴定该病害,并通过进一步分析病害与寄主植物的互作关系及其各自基因组的特点,从而根据其特性去制定相应的防治策略。

CGMMV作为一种系统侵染的典型种传病害,缺乏准确、高效的检测手段是其近年来快速传播的重要因素。2009年,随着下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)在病毒、类病毒基因组测序、病害检测、诊断、病害流行学以及抗性基因挖掘中的普及应用[96],基于其高通量测序数据的结果、且不需提供特异性病毒检测试剂的特点,再结合CLC Genomics Workbench (QIAGEN,USA,http:∥www.clcbio.com/products/clc-genomics-workbench/#)软件在病原物鉴定及其生物信息学中的强大分析能力,从而使得NGS逐渐成为病害诊断的常规方法,也进一步使得各种侵染或隐藏于传播材料或寄主体内的病毒越来越易于被发现[97]。目前,基于NGS技术鉴定病害的方法,已从植物体内成功鉴定出49个新的RNA、DNA病毒和4个类病毒/类病毒RNAs[98]。随后,Witek等[99]通过研究野生马铃薯近缘种少花龙葵(Solanumamericanum)携带的抗性基因,结合SMRT(单分子实时测序)和RenSeq(抗性基因ENrichment SEQuencing)的新一代测序技术SMRT RenSeq成功分离出对枯萎病有广泛抗性的Rpi-amr3基因。这些新测序技术的应用最大可能地快速发现并鉴定植物材料中携带的病毒,并且极大地缩短了分离抗性基因的时间,间接地减少了作物因病害造成的损失。最近几年,相对于ZEN[100](zinc-finger nuclease)和TALEN[101](transcription activator-like effector nuclease)基因编辑技术的繁琐费时,高效稳定的第三代基因编辑技术CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated genes)逐渐受到研究人员的青睐[102]。CRISPR是最初在E.coli体内被发现,形成于细菌与病毒的互作过程中、由病毒的部分DNA片段嵌入细菌基因组而形成的DNA(脱氧核糖核酸)片段区域[103]。因此,当病毒再次侵染时,由于Cas蛋白酶对病毒基因组的识别、切割而使得寄主产生免疫应答,从而达到保护寄主的目的[104]。目前,该技术已经被成功地应用于改善植物的生物学性状,或利用其特性来增加植物抵御病虫害的能力[105]。例如: Feng通过利用CRISPR/Cas系统定点突变双子叶植物拟南芥的BRI1、JAZ1、GAI基因,结果表明该系统可以准确地造成特定位点DNA双链断裂,且获得效率较高的T1代纯合突变体[106]。Ali证明在本生烟(N.benthamiana)中表达CRISPR/Cas9可有效地推迟或减少番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)的积累,从而消除或减轻寄主植物被感染的症状[107]。不同于CRISPR/Cas系统中RNA引导的DNA剪切,最近由Gao刚发现的NgAgo-gDNA基因编辑技术中DNA引导的DNA剪切,由于其更加高效精确以及具有更大的灵活性而更加有潜力地具有广泛的应用前景[108]。随着基因编辑技术越来越成熟地成功应用于精准农业生产,侵染双子叶葫芦科作物的CGMMV病毒病害将有望得到有效、彻底的控制。

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(责任编辑:田 喆)

Research progress in management of Cucumber green mottle mosaic virus

Liu Huawei1,2, Luo Laixin1,2, Zhu Chunyu3, Liang Chaoqiong1,2, Liu Pengfei1,2, Li Jianqiang1,2

(1. Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing Key Laboratory of Seed Disease Testing and Control (BKL-SDTC), Beijing 100193, China; 2. Beijing Engineering Research Center of Seed and Plant Health (BERC-SPH), Key Laboratory of Plant Pathology, Ministry of Agriculture of P.R China,Beijing 100193, China; 3. Institute for the Control of Agrochemicals, Beijing 100026, China)

Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV) causes devastating disease on cucurbits, and it has been listed as quarantine pathogen in many countries in the world. It was reported in at least 23 provinces in China, causing substantial yield losses and lower market value of cucurbits. This review summarized the current control methods of CGMMV and tried to explore the novel control strategies, including next-generation sequencing (NGS) and gene-editing technology for viral diagnostics and identification, and miRNA mediated-resistance to CGMMV infection.

Cucumbergreenmottlemosaicvirus; management method; research progress

2016-03-24

2016-05-27

公益性行业(农业)科研专项(201303028)；国家自然科学基金(31371910)

S 436.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.004

* 通信作者 E-mail: lijq231@cau.edu.cn