李雪丽，唐由之，范吉平，，许　凯，梁　洁，梁丽娜

·论著：实验研究·

补肾益精方对RCS大鼠视网膜变性损伤的保护作用研究

李雪丽1，2，唐由之2，范吉平2，3，许凯3，梁洁2，梁丽娜2

目的从形态及功能两个方面观察补肾益精方（BSYJ）对RCS大鼠视网膜变性损伤的保护作用。方法采用先天性视网膜色素变性RCS大鼠作为动物模型，将36只RCS大鼠随机分为蒸馏水组和BSYJ组，每组18只，分别予蒸馏水及BSYJ水煎剂灌胃（8.8 g·kg-1），每日1次，以SD大鼠作为正常对照组常规饲养。分别于干预7 d、14 d和28 d进行指标观察，采用视觉电生理仪检测各组大鼠视网膜电图变化；HE染色观察视网膜各层细胞结构和形态的变化，并计数外核层的细胞核数目。结果视网膜电图结果显示，与正常大鼠比较，RCS大鼠ERG波幅明显降低，在7周龄时波幅几近消失。与蒸馏水组相比，治疗7 d时，BSYJ组明视ERG，暗视ERG以及Ops波幅略有提高，但差异无统计学意义（P＞0.05），在治疗14d时，BSYJ组暗视ERG波幅值较蒸馏水组明显提高（P＜0.05），治疗28 d时，BSYJ组明视ERG，暗视ERG以及Ops波幅均较蒸馏水组有明显改善（P＜0.05，P＜0.01）。病理学检查显示，与SD大鼠相比，随着观察时间延长，RCS大鼠视网膜外核层逐渐变薄，外核层细胞数减少。与蒸馏水组比较，BSYJ组在7 d、14 d、28 d观察时间点视网膜形态改善，外核层细胞核数目明显增加（P＜0.05，P＜0.01）。结论BSYJ方对RCS大鼠视网膜变性损伤具有一定的保护作用，可能延缓病情的发展过程。

补肾益精方；视网膜变性；视网膜电图；外核层；内核层

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是严重的致盲性眼病，主要表现为光感受器细胞和色素上皮细胞进行性损伤而导致的视功能障碍〔1〕。目前，典型的RP在世界各地发病率约为1/3000～1/5000〔2〕，世界范围内约有150万RP患者〔3〕，且至今尚无有效的治疗方法。目前研究的方法主要有药物干预、基因治疗、细胞移植替代、神经营养因子干预〔4-6〕。后三种方法虽极具前景，但由于技术、伦理及价格昂贵等难题限制了其临床应用的进程。中医认为RP属于高风雀目范畴，其病机与肾精不足，目失所养有关。补肾益精方（BSYJ）是唐由之研究员多年治疗RP的经验方，前期临床初步观察发现，BSYJ对RP患者的视功能具有较好的改善作用，但缺乏确切的实验依据以及规范的临床研究予以证实。为进一步明确BSYJ对视网膜色素变性的作用，本研究选择先天性RP动物RCS大鼠为动物模型，从形态学及功能两个方面观察BSYJ对其视网膜变性损伤的保护作用，为BSYJ临床治疗RP提供实验依据和理论参考。

1　材料与方法

1.1动物

SD大鼠，18只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；RCS大鼠，36只，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供。大鼠均为3周龄，雄性，饲养于屏障环境，室温控制在20～26℃，相对湿度控制在40～70%，光照12 h明暗交替。

1.2主要试剂及仪器

实验用药为BSYJ（药物组成：首乌，黄精，枸杞子等）按原方配伍制备水煎液浓缩而成，由中国中医科学院眼科医院药学部提供。水合氯醛（国药集团工业股份有限公司）；盐酸氯胺酮注射液（福建古田药业有限公司）；盐酸塞拉嗪注射液（吉林省华牧动物保健品有限公司）；复方托吡卡胺滴眼液（参天制药中国有限公司）；盐酸奥布卡因滴眼液（参天制药中国有限公司）；卡波姆滴眼液（Dr.Gerhard Mann， Chem.-Pharm.Fabrik GmbH，德国）；HE染色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；RETI-scan系统视觉电生理检测仪、Ganzfeld全视野刺激器（均为罗兰公司，德国）；EG1150模块化组织包埋中心HI1210、RM2245轮转式切片机、HI1210摊片机、HI1220烘片机、DM2500显微镜（均为LEICA，德国）。

1.3分组与给药

SD大鼠18只为正常组（Control group）；RCS大鼠为实验组动物，共36只，随机分为蒸馏水组（Vehicle group）和中药组（BSYJ group），每组18只。中药组：BSYJ 8.8 g·kg-1灌胃给药，每日1次，蒸馏水组灌服等量的蒸馏水，分别于7 d、14 d、28 d进行相关指标评价，每个时间点取6只动物，进行相应操作和各个实验指标测定。

1.4闪光视网膜电图（flashelectroretinogram，F-ERG）测定

实验前将各组大鼠转移至暗房过夜，暗适应后采用盐酸氯胺酮-盐酸塞拉嗪混合麻醉药（v：v=1：7）肌注麻醉大鼠，行双眼ERG检测，所有步骤均在暗红灯下操作。首先，采用复方托吡卡胺滴眼液常规散瞳20 min，再滴盐酸奥布卡因行角膜表面麻醉。测定前，于角膜中央滴卡波姆眼用凝胶，安装金箔环状角膜电极，参考电极和接地电极分别置于大鼠额部中央和同侧下肢皮下。以Ganzfeld全视野刺激器进行刺激，检测暗适应条件下3.0 cd·s·m2ERG和振荡电位（oscillatory potentials，OPs）；再以30 cd·m2白色背景光下明适应10 min后测定3.0 cd·s·m2ERG。测定过程中，所有刺激间隔时间为30 s，采样频率为0.06 Hz；通频带为0.3～150 Hz，各电极间阻抗始终保持＜5 kΩ。分别记录ERG的a波和b波峰时值（ms）和振幅值（μv），并对暗适应条件下3.0 cd·s·m2ERG b波、OPs和明适应条件下3.0 cd·s·m2ERG b波的振幅值（μv）进行统计学分析。

1.5HE染色观察视网膜组织病理学变化

F-ERG检查结束后，水合氯醛麻醉大鼠（ip.350mg·kg-1），快速摘取眼球，置于4%多聚甲醛中固定，常规脱水，石蜡包埋，经视神经矢状面行连续4 μm切片，切片过视神经。常规HE染色，光学显微镜下观察视网膜各层结构变化，计数内核层（inner nuclear layer，INL）和外核层（outer nuclear layer，ONL）细胞核层数，并于400放大倍数，选择不重叠的4个视野（以视神经为中点的两侧各拍摄2个视野）摄片。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，计数每个视野中两个50 μm长度范围内ONL的细胞核数并取平均值，进行统计学分析。

1.6统计学方法

用origin 8.0软件进行统计，各组实验数据通过正态性分布、方差齐性检验后，以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1ERG检测结果

暗视ERG：由图1可见，与各自正常组相比，蒸馏水组ERG b波振幅均明显降低（F=1.19664，P= 2.87068E-5；F=1.1804，P=2.78186E-10；F=0.60715，P=2.44214E-15）；蒸馏水组14 d和28 d未记录到较典型的ERG反应图形，且28 d时ERG反应图形接近熄灭型。BSYJ治疗7 d后，RCS大鼠ERG b波振幅与模型组相比没有明显差异；BSYJ治疗14 d和28 d后，ERG呈现较典型的ERG反应图形，且b波振幅呈明显升高，与蒸馏水组相比，差异具有统计学意义（F=1.1804，P=0.01977；F=0.60715，P=1.35215E-5）。

图1　A各组大鼠暗适应ERG混合反应图形

图1　BBSYJ对RCS大鼠暗适应ERG混合反应b波的影响（，n=6）

明视ERG：蒸馏水组和BSYJ组28 d时均无典型的明适应ERG反应图形，除此外，其余各组均可记录到典型的明适应ERG反应图形（图2A）。与各自正常组相比，蒸馏水组ERG b波振幅值均明显降低（F=0.67571，P=3.71493E-4；F=2.04519，P=0.01667；F=1.49947，P=2.5325E-9）；BSYJ分别治疗7 d和14 d后，ERG b波振幅与各自蒸馏水组相比差异无统计学意义；BSYJ治疗28 d后，RCS大鼠明视ERG b波振幅值明显增加，与蒸馏水组相比（F=1.44947， P=0.02454），差异具有统计学意义（图2B）。

OPs：除蒸馏水组28 d时无典型的明适应OPs图形外，其余各组均可记录到典型的OPs图形（图3A）。与各自正常对照组相比，蒸馏水组RCS大鼠OPs总振幅值均明显降低（F=5.13529，P=8.61137 E-9；F=3.36573，P=4.44844E-12；F=3.21127，P= 7.47635E-14）；而BSYJ治疗28 d后，RCS大鼠OPs总振幅值明显增加，与蒸馏水组相比（F=3.21127，P=0.00608），差异具有统计学意义（图3B）。

2.2HE染色观察视网膜组织病理学改变

光学显微镜下观察各组大鼠视网膜HE染色切片（图4A）。正常组7 d、14 d和28 d大鼠视网膜分层清晰，各层细胞排列整齐，结构无异常（图4B），INL由4～7层相对较大的细胞核构成；ONL由10～14层排列紧密、相对较小的细胞核构成。蒸馏水组7 d时RCS大鼠视网膜INL由4～6层细胞核组成，ONL由6～8层细胞核组成，与正常组7 d时相比，ONL胞核排列疏松，且数量明显减少（F=3.05179，P= 1.04968E-8）；BSYJ治疗7 d后，视网膜ONL胞核排列整齐致密，数量明显增加（F=3.05179，P=0.01576）。蒸馏水组14 d、28 d时RCS大鼠视网膜ONL逐渐变薄，由4～6层变为2～4层，细胞核排列更加疏松，可见空泡，特别是胞核数目均明显减少，与各自正常组比较差异均有统计学意义（F=1.58262，P=2.82334 E-8；F=1.49625，P=1.86896E-13）。BSYJ分别治疗14 d和28 d后，ONL能够维持在5～8层和3～5层，细胞排列相对整齐，胞核的丢失得到明显控制，与各自蒸馏水组相比（F=1.58262，P=0.01442；F=1.49625，P=1.54975E-5），差异均有统计学意义（表1）。

图2　A各组大鼠明适应ERG反应图形

图2　BBSYJ方对RCS大鼠明适应ERG b波振幅的影响（，n=6）

图3　A各组大鼠暗适应OPs反应图形

3　讨论

本研究选择RCS大鼠为研究对象，观察了BSYJ对实验性RP的保护作用。RCS大鼠是一种较成熟的视网膜退化性病变动物，具有人类RP的主要特征，是广泛用于RP病因及治疗方法研究的经典模型〔7〕。RCS大鼠出生后2周视网膜形态和功能表现正常，3周时光感受器细胞核数目开始减少，5周后F-ERG波幅值开始下降，约8周时呈熄灭状态，且光感受器细胞接近消失，在本实验中也发现，同龄的RCS大鼠与SD大鼠相比，无论是视网膜ERG检查还是组织病理学观察，RCS大鼠均出现了明显的异常改变，提示RCS大鼠在病变过程中，视网膜的形态和功能都出现了类似于RP的改变，这与已有的研究报道〔8〕是相似的。

图3　BBSYJ对RCS大鼠暗适应OPs总振幅的影响（，n=6）

图4　A视网膜各层示意图（HE染色，400×）

图4　B各组大鼠视网膜组织病理学改变（HE染色，400×）

表1　BSYJ对大鼠视网膜感光细胞数量的影响（，n=6）

表1　BSYJ对大鼠视网膜感光细胞数量的影响（，n=6）

注：①与正常组比较，P＜0.01；与蒸馏水组比较，②P＜0.05，③P＜0.01。正常组：SD大鼠；蒸馏水组和BSYJ组为RCS大鼠。BSYJ：补肾益精方

外核层细胞核数/ 5 0 μ m 7 d 1 4 d 2 8 d正常组2 1 5 ± 2 2 1 9 8 ± 2 2 1 8 2 ± 1 2蒸馏水组1 1 3 ± 8①9 4 ± 1 1①4 4 ± 6①B S Y J组1 4 0 ± 9②1 2 4 ± 1 2②8 0 ± 9③组别

本实验以BSYJ对3周龄RCS大鼠进行治疗，于治疗7 d，14 d，28 d后分别进行相关评价。结果发现，BSYJ治疗14 d后暗视ERG波幅值较蒸馏水组显著增加，BSYJ治疗28 d的RCS大鼠暗视ERG、明视ERG波幅值及OPs上升支节律性小波〔9〕总振幅值与蒸馏水组相比均明显增加。暗视ERG及明视ERG主要反映了视杆细胞和视锥细胞的功能，而OPs被认为起源于内层视网膜，可能来自无长突细胞到双极细胞间的抑制性反馈回路〔10〕，这表明BSYJ能够较好的维持并改善RCS大鼠外层视网膜和内层视网膜的功能。本研究进一步通过组织病理学观察了RCS大鼠视网膜的形态结构。随着鼠龄的增加，RCS大鼠视网膜外核层逐渐变薄，细胞核排列渐变疏松且数目减少；而BSYJ治疗7 d、14 d、28 d后视网膜各层结构排列相对规整，外核层层数以及细胞核密度较蒸馏水组明显增加，表明视网膜形态和结构得到了改善。

中医认为RP是由于先天禀赋不足或脏腑内损，气血不足，真元耗伤，精气不能上荣于目所致，故以“补肾益精”为其基本治则。BSYJ由唐由之研究员多年临床经验总结而得，该方重用制首乌、黄精为君药，以补肝肾、益精血、填精髓，枸杞子滋养肝肾、益精明目，菟丝子补肾益精、养肝明目共为臣药，同时佐以其它理气活血之药，使其补而不滞，静中有动，精血得以上注畅达于目〔11〕，使髓海得充，目络得养，共奏补肾明目之功效。现代药理学研究表明，制首乌的有效成分二苯乙烯苷对神经细胞有保护作用，并且能促进神经干细胞的自我更新，向神经元方向分化〔12-13〕。黄精中有效成分黄精多糖对APP转基因小鼠学习记忆能力及海马CAI区超微结构具有改善作用，可使脑组织中神经元数目增多，神经变性减轻〔14〕。枸杞子自古被誉为“养肝明目”之圣药，近年来的研究表明枸杞子及其多糖成分对防治RP、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、青光眼等眼部疾病均有一定功效〔15-19〕。随着现代药理研究的逐步深入，各单味药的作用机制也将更加明确，这不仅为BSYJ治疗实验性RP的研究提供重要依据，也为其进一步开发提供重要参考。

综上所述，本研究初步证明BSYJ对RCS大鼠视网膜进行性损伤具有较好的保护作用，一定程度上延缓了疾病的进程，但其作用环节及机制还有待进一步研究阐明。

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Study of Bushenyijing Decoction's protective effect on retinal degeneration in RCS rats

LI Xueli,TANG Youzhi,FAN Jiping,et al.
Post-doctoral Research Station,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing, 100700,China

OBJECTIVE To investigate the effect of Bushenyijing Decoction（BD）on retinopathy in RCS rats by studying the retinal function and histopathology.METHODS Royal College of Surgeons（RCS）rats were used as an animal model of retinal degeneration.Thirty-six RCS rats were randomly divided into two groups:the distilled water group and the Bushenyijing Decoction（BD）group while SD rats were used as normal control group.The mice of BSYJF group were administrated with Bushenyijing Decoction（BD）solution by gavage（8.8 g·kg-1）,and the mice in distilled water group were treated with distilled water by gavage,while the SD mice were fed normally.At the 7thdays,14thdays and 28thdays after treatment,their effects were assessed respectively.The flash electroretinogram（FERG）was used to detect the function of the retina.Hematoxylin-eosin（HE）staining was used to evaluate the retinal histopathological changes and the number of photoreceptor nucleiin the outer nuclear layer（ONL）.RESULTS The ERG result showed that in contrast with normal control group,the amplitude of RCS rats was significantly decreased,and it almost disappeared when the RCS rats were 7 weeks old.At 7thday after treatment,in comparison with the distilled water group,the amplitude of photopic ERG,scotopic ERG and Ops of the Bushenyijing Decoction（BD）group was increased slightly,but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.At 14thday after treatment,b-wave amplitudes of scotopic ERG in the BSYJ group was significantly higher than the distilled water group（P＜0.05）.At 28thday after treatment, the amplitudes of scotopic ERG,photopic ERG,andOPs in Bushenyijing Decoction（BD）group were all markedly higher than that in distilled water group（P＜0.05,P＜0.01）.It was shown by pathological examination that in comparison with SD mice,the ONL layer in the RCS rats attenuated gradually,and the number of nucleus decreased either.Comparing with the distilled water group,the pathological change in the BSYJ group was improved and more nuclei were preserved at all three time points.（P＜0.05,P＜0.01）.CONCLUSION BThe Bushenyijing Decoction（BD）had protective effect on retinal degeneration lesion in RCS rats,and it might delay the development process of retinal degeneration.

Bushenyijing Decoction（BD）;retinal degeneration;flash electroretinogram;outer nuclear layer; inner nuclear layer

R285.5

A

1002-4379（2016）03-0144-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.03.002

国家自然科学基金（81473736）；国家人力资源和社会保障部留学人员科技活动择优项目

1中国中医科学院博士后流动站，北京100070 2中国中医科学院眼科医院，北京100040 3中国中医科学院，北京100070

梁丽娜，E-mail：lianglina2001@hotmail.com