贾又山，龙欢，高国策，刘书畅，宋培勇

（遵义师范学院生物与农业科技学院，贵州遵义563002）

贵州西南部土壤放线菌资源及其抗菌活性

贾又山，龙欢，高国策，刘书畅，宋培勇

（遵义师范学院生物与农业科技学院，贵州遵义563002）

为了解贵州西南部土壤放线菌资源及其抗菌活性，从采集土样中分离得到28株放线菌，对其中19株进行了形态学鉴定，其中4株还做了分子鉴定和系统发育分析，并检测了其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌和拟盘多毛孢的抗菌效果。结果显示，MLH17、MLH18、MLH24、HJ1、C12对金黄色葡萄球菌抑菌效果强，MLH9、MLH3、MLH21、MLH26对金黄色葡萄球菌抑菌效果弱；对大肠杆菌、齐整小核菌和拟盘多毛孢都没有抑制效果。鉴定结果表明链霉菌为优势菌属。

贵州西南部；土壤放线菌；鉴定；抗菌活性

放线菌属于原核生物界、厚壁菌门、丝状菌纲、放线菌目[1]。放线菌以产生抗生素闻名，如链霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素、四环素、新生霉素、庆大霉素、丝裂霉素、马杜拉霉素、阿维菌素、春雷霉素、庆丰霉素、井冈霉素、农抗120、多抗霉素、中生菌素、宁南霉素、梧宁霉素和武夷菌素等[1-3]。抗生素不仅常用于人畜的抗感染治疗，对农作物的病虫害防治也能起到重要作用。但是，随着微生物耐药性的增强，在临床医学和生产实践中可选择的抗生素越来越少，对新抗生素尤其是具有特殊抑抗机制抗生素的需求日益增加。在特殊生境中繁衍生息的微生物为适应外界多种逆境因子，经长期演化，逐步产生了独特的防御和代谢系统，因此，从特殊环境的土著微生物或变异微生物培养液中发现新抗生素的几率相对较高[4]，已成为发现新抗生素的重要策略。如董艳萍等[5]从塔克拉玛干沙漠南麓17份土壤样品中分离纯化得到368株放线菌，从中就发现一株放线菌（SC8A-24）为潜在的新种。贵州马岭河大峡谷和花江大峡谷地处云贵高原西部，地形地貌独特，是筛选新抗生素产生菌的生境之一。金黄色葡萄球菌是6种常见院内感染病原体（ESKAPE）之一。ESKAPE均为多重耐药细菌，而其中更不乏所谓的“超级细菌”，如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、产ESBL的肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等[6]。大肠杆菌O157:H7是引起人肠出血性腹泻的罪魁祸首，而齐整小核菌、拟盘多毛孢是植物常见的病原菌。所以本文选择上述菌株作为拮抗对象，用于放线菌抗菌活性筛选。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1土样

2014年5月，从贵州省黔西南布依族苗族自治州马岭河大峡谷和安顺市花江大峡谷采集。

1.1.2培养基

高氏1号培养基、牛肉膏培养基、PDA培养基均按文献[7]介绍的方法进行配制。

1.1.3供试菌株

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、拟盘多毛孢，由遵义师范学院微生物实验室提供。

1.1.4主要试剂

1.1.5主要仪器

微波炉（三洋公司），离心机（Thermo Scientific），凝胶成像系统（北京六一），PCR扩增仪为DNA Engine peltier Thermal Cycler（Bio Rad）。

1.2方法

1.2.1放线菌分离

采集的土样先在实验室风干20d，碾碎。取l0-4、l0-5稀释度土壤悬液，涂于高氏1号培养基上，每个平板200µL，培养6～10d，挑菌纯化两次，斜面保存。

1.2.2放线菌形态特征观察

用插片法[7]将灭菌盖玻片插于接有放线菌的高氏I号平板，每个平板插2片，倒置后在28～30℃的培养箱中培养5～7d，美蓝染色，显微镜下观察拍照。

1.2.3抗菌活性筛选

放线菌对细菌的抗菌活性筛选：制备牛肉膏蛋白胨液体培养基2份，分别接种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，培养24h待其变浑浊后取出，无菌吸取5mL注入冷却到约45～50℃未凝固的牛肉膏蛋白胨固体培养基中，立即趁热将其摇匀，倒入灭菌的培养皿中，得到含菌培养基，待培养基凝固后，用直径为0.5cm的打孔器打取高氏一号培养基中的放线菌，用灭菌的解剖针挑取菌块放到含菌平板上，每个平板放置2个。28℃培养4d，取出观察并测量抑菌圈大小，每个菌块用十字交叉法测量2次，取平均值。根据抑菌圈的直径判断其抗菌活性：≤5 mm，无抑菌活性；6～15 mm，抑菌作用弱；>15 mm，抑菌作用强[8]。

放线菌对真菌的抗菌活性筛选[9]：无菌吸取3mL放线菌发酵液，注入到45～50℃的PDA培养基中，立即趁热摇匀，倒入灭菌的培养皿中，待其凝固后，用直径为0.5cm的打孔器打取真菌的菌饼，并将菌饼用灭菌的解剖针挑起后放置到放线菌平板上，每个平板放置2个菌饼，28℃培养5 d后，观察并测量抑菌圈的直径。每个菌落用十字交叉法测量两次，取平均值。

1.2.4DNA提取

采用微波法[8,10]用无菌牙签挑取绿豆大小的单菌落或菌苔于1.5 mL EP管中，加1 mL洗涤液，涡旋5s，5700 r/min离心1 min，弃上清。沉淀加50L裂解液，涡旋混匀，于微波炉中600 W处理45s，加入65℃预热的抽提液400L，涡旋5s。加入450L酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提，1000 r/min离心10 min。取上清液加400L酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）再抽提一次。取水相加等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀1h以上，12000r/min离心20min，弃上清，充分干燥，溶于20L 1×TE溶液中。取10L DNA溶液于0.8%琼脂糖凝胶80V电泳1.5h，260nm紫外灯下观察并照相。

1.2.516S rDNA PCR扩增

反应条件：94℃10 min;95℃30s，56℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。16SrDNA PCR扩增产物（未纯化）交由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.6分子鉴定及系统发育分析

登陆NCBI官网输入16SrDNA测序结果进行BLAST比对，查找相似性最高的菌株。利用MEGA4.1构建系统发育树。

2　结果与分析

2.1放线菌形态特征

用高氏1号培养基从4份土壤样品中共分离得到28株放线菌，根据菌落形态初步筛选19株进行形态鉴定（见表1）。MLH1和MLH3呈短螺旋状，气生菌丝及基内菌丝基本相同。MLH13和MLH23孢子丝形态为分枝断裂状，但MLH13气生菌丝为粉红色，中间为灰色，基内菌丝为白色。MLH12和MLH18孢子丝也呈分枝断裂状，气生菌丝和基内菌丝基本相似。MLH22孢子丝与MLH28相同，MLH21孢子丝呈短紧螺旋状，气生菌丝为灰色，基内菌丝为白色或黑色。MLH9还产生了紫色色素。HJ1孢子丝呈螺旋形，气生和基内菌丝颜色为紫色和紫褐色。MLH6、MLH7和MLH14的孢子丝呈钩形，其气生和基内菌丝颜色各不相同。MLH5和MLH15的孢子丝呈长松和短紧螺旋状，菌丝颜色也不尽相同。从孢子丝形态看，多数为链霉菌。

表1　放线菌的形态特征

2.2抗菌活性

抗菌检测结果表明（见表2），放线菌MLH18、HJ1、MLH9、MLH17、C12、MLH24、MLH3对金黄色葡萄球菌有不同程度的抑菌效果：其中MLH18、HJ1、MLH17、C12抑菌圈直径均大于15mm，抑菌作用强；MLH3、MLH9、MLH21、MLH24、MLH6抑菌圈直径在6～15mm，抑菌作用弱；各分离菌株对大肠杆菌、齐整小核菌、拟盘多毛孢均无抑制作用。据此推测MLH18、HJ1、MLH17、C12等产生的活性物质可能对病菌细胞壁肽聚糖的合成有抑制作用。

表2　放线菌抗菌活性

图1　MLH18和HJ1对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

2.3放线菌DNA提取及16S rDNA PCR扩增

选取抑菌效果好的5株菌株，用微波法提取放线菌基因组DNA，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（见图2），条带清晰，说明微波法提取放线菌DNA是一种方便高效的方法。但MLH17、MLH24的DNA条带有拖尾现象。

图2　放线菌基因组DNA

以所提取的基因组 DNA为模板，进行 16S rDNA PCR扩增，皆扩增出约1500bp左右的DNA条带，且条带清晰明亮（见图3）。

图3　放线菌16S rDNA PCR结果

2.4分子鉴定及系统发育树分析

16SrDNA PCR扩增产物由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。测序结果显示，MLH24正反测序都出现双峰，可能是由于提取样品不纯，致使测序结果不可靠。将其他4株的测序结果登陆NCBI官网，进行BLAST比对，结果见表3。根据相似性>97%作为种的划分标准[11]，HJ1、C12、MLH17与同源菌株的相似性为99%，鉴定为链霉菌属MLH18与同源菌株的相似性为99%，鉴定为放线菌属

将4株菌株的16S rDNA序列用MEGA4.1软件构建系统发育树（见图4），由图4可知这8株放线菌分为两大支，其中C12和链霉菌属聚为一支，HJ1和链霉菌属聚为一支；MLH17和链霉菌属聚为一支，MLH18和放线菌属聚为一支。从系统发育树可知C12和HJ1的亲缘关系比较近，而与MLH17和MLH18的亲缘关系相对较远，MLH17和MLH18的亲缘关系比较近。

表3　部分放线菌分离菌株的分子鉴定

图4　4株放线菌及其同原菌株基于16S rDNA序列构建的系统发育树

3　结论

本文从贵州西南部土壤中分离得到28株放线菌，对其中的19株进行了形态学鉴定及抗菌活性筛选，并挑选了5株进行了分子鉴定及系统发育分析，结果表明：MLH18、HJ1、MLH17、C12对金黄色葡萄球菌抑菌作用强，MLH3、MLH9、MLH21、MLH24、MLH6对金黄色葡萄球菌抑菌作用弱。测试的19株放线菌分离株对大肠杆菌、齐整小核菌、拟盘多毛孢均没有抑菌效果。分子鉴定及系统发育分析表明，MLH17、HJ1、C12为链霉菌属；MLH18为放线菌属。实验结果说明贵州西南部土壤放线菌资源比较丰富，链霉菌为其优势菌属。部分菌株还有很好的抗菌活性及产色素潜能，通过抗菌活性产物及生物色素的进一步鉴定，可能筛选出具有一定商业价值的优良菌株。

[1]阮继生,黄英.放线菌快速鉴定与系统分类[M].北京:科学出版社,2011.

[2]尹萃耘.农用抗生素和抗生菌的筛选[J].抗生素,1983,8(1): 64-65.

[3]蒋细良,谢德龄,倪楚芳,等.中生菌素的抗生作用[J].植物病理学报,1997,27(2):133-138．

[4]李文均,徐平,徐丽华,等.极端环境中的放线菌资源[J].微生物学通报,2003,30(4):125-127.

[5]董艳萍,郭琳,旭格拉·哈布丁,等.塔克拉玛干沙漠南麓土壤放线菌资源勘探及抗菌活性筛选[J].中国抗生素杂志,2013, 38(4):241-247.

[6]Bodro M,Sabé N,Tubau F,et al.Risk factors and outcomes of bacteremia caused by drug-resistant ESKAPE pathogens in solidorgan transplant recipients[J].Transplantation,2013,96(9): 843-849.

[7]黄秀梨,辛明秀.微生物学实验指导(第2版)[M].北京:高等教育出版社,2008.31-32．

[8]徐丽华,李文均,刘志恒,等.放线菌系统学——原理、方法与实践[M].北京:科学出版社,2007.40-45,97-98．

[9]吴庆菊,曾会才,何娜,等.45种放线菌发酵液对香蕉枯萎病菌的室内毒力测定[J].广东农业科学,2008,(11):65-67.

[10]徐平,李文均,徐丽华,等.微波法快速提取放线菌基因组DNA[J].微生物学通报,2003,30(4):82-84．

[11]Stackebrandt E,Goebel B M.Taxonomic note:a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J].Int J Syst Bacteriol,1994,44(000000004):846-849．

（责任编辑：朱彬）

Soil Actinomycetes and Their Antimicrobial Activity in Southwest
of Guizhou

JIA You-shan，LONG Huan，GAO Guo-ce，LIU Shu-chang，SONG Pei-yong
（Collge of Biological and Agricultural science and technology,Zunyi Nomal College,Zunyi 563002,China）

In order to understand the soil actinomycetes resources and their antimicrobial activity in southwest of Guizhou,we carried out this research.28 strains of actinomycetes are isolated from the soil samples collected.The morphological identification was carried out to the 19 strains above.Molecular identification and phylogenetic analysis was carried out to 4 strains of the 19 actinomycetes above. Antimicrobial effect of theisolateswastestedagainst Staphylococcusaureus,Escherichia coil,Sclerotiumrolfsiiand Pestalotiopsis clavispora.The results show that antimicrobial effect of MLH17、MLH18、MLH24、HJ1 and C12 was strong on Staphylococcus aureus,yet MLH9,MLH3,MLH21 and MLH26 was weak.Except for Staphylococcus aureus,inhibity effect was found on the others.Identification results show that streptomyce was the domain genus.

southwest of Guizhou;soil actinomyces;identification;Antimicrobial activity

Q939.132

A

1009-3583（2016）-0102-05

2016-04-11

贵州省大学生创新训练资助项目（201410664010）

贾又山，男，贵州遵义人，遵义师范学院生物与农业科技学院2012级植物生物技术专业本科学生。

作者通讯：py66song@126.com