李焕斌 熊爱辉 （湖南省邵阳市新宁县一渡水镇动物防疫站 422714)

猪口蹄疫O型灭活疫苗制苗毒株的筛选

李焕斌 熊爱辉 （湖南省邵阳市新宁县一渡水镇动物防疫站 422714)

目前我国猪群中主要流行O型口蹄疫病毒，分属于古典中国 （Cathay)拓扑型、中东-南亚 （ME-SA)拓扑型、东南亚 （SEA)拓扑型。长期以来，猪群中一直以Cathay拓扑型占优势，经过多年的遗传演化，进一步可以分为老毒株和新型毒株。在猪群中不时有中东南亚拓扑型的泛亚毒株流行。2010年前后由于新毒株侵入，又有东南亚拓扑型的缅甸-98型毒株流行。选择从临床发病猪最新分离鉴定的病毒材料12株，经综合分析后筛选发现O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3个毒株对猪毒力强，对BHK-21细胞具有良好的适应性，免疫原性好，生物学特性符合疫苗毒株的要求，但其单苗免疫覆盖面有限，需要进一步进行组合制备免疫覆盖面广的新型疫苗。

猪口蹄疫；灭活疫苗；疫苗毒株；免疫

我国猪口蹄疫主要是O型口蹄疫，偶尔也感染亚洲I型和A型口蹄疫。从20世纪60年代中期开始，O型猪口蹄疫发病逐渐上升，主要流行毒株为古典中国 （Cathay）拓扑型病毒，经过50年的流行，该谱系病毒的感染发病率发生明显变化，出现了所谓老毒株、变异毒株和新变异毒株，病毒的变异使得其致病力越来越强，防控难度越来越大[1]。使口蹄疫疫情更加复杂和严重的是1999年泛亚毒株侵入我国，该毒株初期主要感染牛群，经过10多年在猪群中的变异，出现了泛亚猪体适应毒株，该毒株致病力强，曾造成南方数省猪只死亡。近年来，特别是2010年，由于新型的缅甸-98毒株侵入我国，该毒株对猪群、牛群感染力均很强，造成了重大损失。目前我国猪群中，流行的O型口蹄疫有3个拓扑型，多个谱系病毒共存的复杂局面[2]。

我国采取以免疫为主的综合防控措施，20世纪60年代，曾使用弱毒疫苗防疫，80年代研制出了第1代灭活疫苗。虽然推出不少种类的疫苗，但面临猪口蹄疫病毒流行复杂的局面，须对猪群中未来可能流行的口蹄疫病毒进行1次综合评价，筛选出免疫普广的疫苗毒株。

本研究将通过综合分析我国猪群中流行的主要病毒株，研究高效、广谱的新型疫苗以覆盖目前国内猪群中主要流行毒株为目标。选择免疫原性好、抗原普广、对试验动物及本动物致病力强、毒力稳定，以及对研制疫苗材料具有良好适应性的制苗种毒，是疫苗研制和免疫成败的关键。本试验将从临床发病猪分离鉴定的12株病毒材料分别进行VP1核苷酸序列测定、乳鼠适应性及毒力测定、细胞适应性及毒力比较、试验室细胞传代和生产用转瓶培养特性比较和毒力测定，部分毒株对猪感染性测定、抗原关系分析、免疫普及免疫原性测定，筛选符合制苗毒株要求的候选制苗毒株。

1 材料与方法

1.1 试验动物

乳鼠：为疾病预防控制中心引进的SPF3日龄乳鼠。

猪：仔猪和健康长白猪均为购自非口蹄疫疫区，未曾免疫过口蹄疫O型灭活疫苗，经检验口蹄疫O型血清抗体为阴性 （乳鼠中和抗体效价＜1∶4， 或者细胞中和抗体效价＜1∶8，或者ELISA抗体效价＜1∶8和3ABC抗体检测D值小于0.2）。交叉攻毒试验用猪体重40kg左右，安全性检验用猪为30～40日龄。

1.2 细胞

为疾病预防控制中心引进的BHK-21细胞，传代后冻存于液氮中；PK15细胞由疾病预防控制中心引进。

1.3 毒株的遗传关系分析

将原始病毒材料和本研究传代3代的病毒材料，按照常规RT-PCR方法进行扩增毒株的VP1基因，PCR产物直接测序，确认序列并确定基因型。同时与国内外口蹄疫参考毒株进行比较，绘制系统发生树。根据VP1基因核苷酸序列的同源性，分析毒株之间的遗传学关系。

1.4 毒株主要生物学特性分析

1.4.1 病毒的乳鼠适应性研究

将国家口蹄疫参考试验室提供的12株病毒乳鼠组织毒，分别按照1∶10比例加入MEM培养基研磨制成悬液，4℃浸润过夜，2～3日龄昆明系小白鼠每只背部皮下注射0.2 mL，逐日观察记录乳鼠的发病死亡情况，弃掉10h内死亡的乳鼠，收获10h后濒死或者死亡的乳鼠，去掉头部、皮毛、爪子后，剪成小块后加入磷酸甘油，于-70℃保存，同时如前步骤处理连续传代使乳鼠发病死亡时间缩短稳定在16～30h。记录各毒株不同代次乳鼠发病、死亡时间。当传代毒株稳定后制备种子批，并测定其对乳鼠的半数死亡量，以此来评价对乳鼠的毒力[3]。

1.4.2 病毒的细胞适应性研究

对12株病毒的传代乳鼠病毒进行BHK-21细胞适应试验，病毒接种量为10%，培养时间为细胞出现病变为止，记录具体时间，连续传代使收毒时间稳定在24h以内。连续盲传4代不能产生细胞病变的病毒，通过传代PK15细胞和BHK-21细胞交叉传代的方法进行，接毒量为10%，细胞病变达到90%以上时收获病毒。

1.5 对猪致病性的研究和康复血清的制备

将对乳鼠致病力强、细胞适应性好的候选毒株——O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒作1∶10研磨浸润过夜处理后，肌肉注射2头易感猪，观察记录发病情况和对猪的毒力，并在21d采血、分离血清，56℃灭活30min后过滤无菌处理后分装保存，并采用O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒和细胞中和试验测定血清效价，用于r值的测定。

1.6 免疫原性的测定

将备选毒株各试一批疫苗进行交叉攻毒试验，每种疫苗各免疫40kg左右的健康猪40头，每头免疫1头份，分为4组，每组10头，免疫28d后分别用检验用毒进行攻毒试验，设立对照组，统计结果并计算保护率。

1.7 制苗候选毒株的确定

综合分析各毒株的生物学特性、遗传关系、抗原关系、免疫原性，从不同的谱系中选择适宜的制苗毒株。

2 结果

2.1 病毒的鉴定

2.1.1 病毒序列测定及定型

将12株病毒进行VP1核苷酸序列分析，并与国内外参考毒株进行比较，结果表明，12株病毒均为O型口蹄疫病毒，同源性见表1。12株病毒与OZK的VP1序列的同源性为 76～97%。

2.2 病毒的生物学特性

2.2.1 对猪的致病力研究和康复血清的制备

O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒接种猪后，分别于24～48h后发病，表现明显的口蹄疫临床症状。最早可见蹄部病变，随后10d后开始康复。

2.2.2 抗原关系分析

选择血清抗体效价较高的猪血清用于中和试验，将O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11细胞毒分装，上述3种血清分别与4个病毒株进行交叉细胞中和试验，试验重复3次计算平均值，见表2。

由表中数据可知O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作为疫苗毒株以最大限度覆盖目前的猪口蹄疫病毒。

2.2.3 制苗候选毒株的确定

通过对12株病毒生物学特性的研究和遗传学关系分析，选择了分属于Cathay拓扑型、中东-南亚拓扑型和东南亚拓扑型的3株病毒O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株，其对乳鼠、细胞都表现出良好的适应性和较强的毒力，3株病毒均表现出良好的免疫原性，综合分析O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作为制苗株的候选毒株。

3 结论与讨论

经VP1核苷酸序列测定，分析研究12株病毒属于中国拓扑型、中东-南亚拓扑型、东南亚拓扑型三个拓扑型[4]，分别经过乳鼠适应性及毒力测定、细胞适应性及毒力比较、试验室细胞传代和生产用转瓶培养特性比较和毒力测定、对猪感染性测定和康复学清制备、细胞中和试验r值测定、单价疫苗制备和猪体攻毒交叉保护试验、免疫原性测定，综合分析后筛选发现O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3个毒株对试验动物和本动物毒力强，对BHK-21细胞具有良好的适应性，免疫原性好，生物学特性符合疫苗毒株的要求，但其单苗免疫覆盖面有限，需要进一步进行组合制备免疫覆盖面广德新型疫苗。

表1 12株病毒VP1核苷酸序列分析结果

表2 3种血清抗原关系

采用O/HB07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株的遗传关系分析、乳鼠及细胞适应性研究、抗原关系测定、免疫原性等方法综合研究，全面对猪群中流行的不同拓扑性O型口蹄疫病毒进行分析，初步掌握了猪群中O型病毒的抗原关系，为研究保护覆盖面较为宽的猪O型口蹄疫灭活疫苗提供了支持。

目前我国猪群中主要流行O型口蹄疫病毒，分属于Cathay拓扑型、中东-南亚拓扑型、东南亚拓扑型，长期以来，猪群中一直以Cathay拓扑型占优势，经过多年的遗传演化，进一步可以分为老毒株和新型毒株。在猪群中不时有中东南亚拓扑型的泛亚毒株流行。2010年前后由于新毒株侵入，又有东南亚拓扑型的缅甸-98型毒株流行。

缅甸-98谱系从2003年就已有该谱系病毒流行，近年来逐渐流行面扩大，从一个侧面反映出现流行疫苗存在一些问题。该谱系病毒不易直接适应BHK-21细胞，但是经过传代3次后收毒，综合评价其细胞毒价和乳鼠毒价，有良好的乳鼠适应性和细胞适应性。综合考虑，O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株MF 4代病毒接种猪后，发现部分猪肌肉注射接种病毒后无任何反应，观察10d后再采血检测血清抗体仍然维持阴性，提醒试验研究时应注意选择动物和疫苗质量评价，选择动物时不仅要注意有无口蹄疫抗体，还要注意猪的易感性，同时提醒应注意研究口蹄疫不同感染途径与致病性的关系。

[1]王继华,邵明,施程洪,等.抗原浓缩纯化工艺降低口蹄疫O型和Asia 1型二价灭活疫苗免疫副反应研究[J].中国预防兽医学报,2011(1):58-61.

[2]王继华,邵明,施程洪,等.抗原浓缩纯化工艺对口蹄疫灭活疫苗免疫效果评价[J].中国兽医学报,2011,31(5):684-686.

[3]库大亮,李冬.口蹄疫灭活疫苗的生产工艺概述[J],中国兽药杂志,2011,45(1):41-44.

[4]周春雷,李冬.口蹄疫及其防制简介[J].中国动物保健,2011(10):40-44.