朴光一王晓明李华崔成哲金一

（1，延边州农业科学院 133002；2，延边华龙集团 133002；3，延边大学 133400)

嗜血支原体感染东方香猪动物模型的建立

朴光一1王晓明1李华2崔成哲1金一3*

（1，延边州农业科学院 133002；2，延边华龙集团 133002；3，延边大学 133400)

猪嗜血支原体也被称为猪附红细胞体，是寄生在猪血液内，主要存在于红细胞表面或游离于血浆及骨髓中而引起动物发病，发病仔猪主要以体温升高、发生贫血、黄疸及母猪流产等症状为特征。本实验研究以延边州农业科学院培育的东方香猪为实验动物，通过注射地塞米松的方法降低其免疫力，然后以腹腔注射方式接种猪嗜血支原体，以建立嗜血支原体感染东方香猪的动物模型。

东方香猪；嗜血支原体；动物模型

东方香猪头形似鼠，四肢细短，黑背白肚，体重多数不足10kg，原产海南省的五指山猪，体形小，肉质细嫩、香味浓，是国际上珍稀的猪种之一。一些研究表明，东方香猪对猪巴氏杆菌、仔猪副伤寒等细菌病毒敏感性强，可用作复制动物模型，并在皮肤烧伤、移植，牙齿、口腔疾病模型，心血管模型等方面有所应用。猪嗜血支原体也被称为猪附红细胞体[1]，发病仔猪主要以体温升高、发生贫血、黄疸及母猪流产等症状为特征。因为东方香猪容易感染猪嗜血支原体且症状明显，适合作为嗜血支原体的动物模型。

1 材料与方法

1.1 试验动物

成年东方香猪10头，其中雄性4头，雌性4头，妊娠母猪2头。按不同年龄、不同性别无菌采集东方香猪抗凝血50份。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与处理

健康东方香猪10头，经鲜血压滴标本和血液涂片，姬姆萨氏染色镜检及PCR方法检测确定无猪嗜血支原体感染后，分为A、B、C、D、E5组，每组2头，A、B、C3组试验猪用免疫抑制剂处理，方法是注射地塞米松，剂量为每头香猪每次注射地塞米松10mg，隔日注射1次，一直注射至试验结束。D组不注射地塞米松，但是感染组。E组不做处理。

1.2.2 猪嗜血支原体阳性血液的采集与鉴定

血液样本压片镜检与染色，甲醇固定，按常规姬姆萨氏染色后镜检。判定标准用PCR检测方法，血液标本PCR扩增后，将扩增产物通过凝胶成像仪观察，若在541bp处得到单一的DNA条带且条带清晰明亮者为阳性，无特异性条带者为阴性。血液压滴标本镜检法，将每1份猪的血液压滴标本置于高倍镜下，观察20个视野，观察到嗜血支原体者为阳性，无嗜血支原体者为阴性；

1.2.3 人工感染试验

用已经计算嗜血支原体感染个数的阳性猪红细胞作为感染香猪的标准样品，感染方法注射地塞米松腹腔10.0ml/头。

1.2.4 临床症状观察

东方香猪在感染嗜血支原体阳性猪红细胞后，每天早9：00和下午4：00观察体温、呼吸、心率变化情况临床表现并做好记录。

1.2.5 香猪血液学检查

感染后每天分别从各组香猪耳静脉采血进行血液压滴镜检和血液涂片染色镜检，连续观察嗜血支原体的感染情况。

1.2.6 香猪血液样本的PCR扩增

以感染阳性猪红细胞作为0d，感染后第1天到第7天，每天分别从各组中的每头香猪采血，从第7天以后，改为每隔2d采血1次，进行PCR扩增。

1.2.7 香猪血清中猪嗜血支原体抗体检测

以感染阳性猪红细胞当天0d，在感染后的第7、14、21、28、35天，分别从无菌采香猪血液约2ml，静止离心保存-20℃冰箱中。用ELISA检测抗体效价。

2 结果与分析

2.1 东方香猪群嗜血支原体感染情况

应用血液压滴标本镜检法、血液涂片染色法和PCR方法对50头份东方香猪血液样本进行猪嗜血支原体感染情况检测，具体检测结果见表1。经统计学分析，血液压滴标本镜检法与PCR检测方法检测的阳性率差异显著 （0.01＜P＜0.05）。

表1 香猪嗜血支原体感染情况

由表2可见，各年龄段的猪均可感染嗜血支原体，但幼龄猪的易感性高于成年猪，其中1～5月龄的阳性率为72.7%，6～12月龄的阳性率为71.4%，12月龄以上的阳性率为63.6%，经统计学分析，不同年龄段之间猪嗜血支原体的感染率差异不显著 （P＞0.05）。

表2 PCR方法检测不同年龄香猪嗜血支原体感染情况

2.2 试验组香猪感染前检查

2.2.1 血液压滴标本检查

经对感染前香猪进行血液压滴标本检查，可见红细胞呈正常形态。

2.2.2 姬姆萨氏染色检查

经对感染前香猪血液进行姬姆萨氏染色镜检，香猪红细胞呈正常形态。

2.3 猪嗜血支原体阳性血液的鉴定

姬姆萨氏染色方法，被检猪血液涂片，姬姆萨氏染色，油镜观察，可见嗜血支原体被染成淡紫色。

2.4 感染后东方香猪的临床症状

感染猪嗜血支原体14d左右，A、B、C、D组东方香猪相继表现出体表及可视黏膜苍白，高热达到42℃，厌食、反应迟钝、消化不良等症状，个别猪黄疽，四肢特别是耳尖边缘发绀。耳朵、颈下、胸前、腹下、四肢内侧等部位皮肤红紫。出现便秘或拉稀，有时便秘和拉稀交替出现。个别猪后肢发生麻痹，不能站立，卧地不起。体温、呼吸、心率变化见表3。E组东方香猪表现正常。

2.5 感染后香猪血液学检查

2.5.1 血液压滴方法检查

香猪人工感染嗜血支原体后的第3～5天，经血液压滴标本检查，可见红细胞有嗜血支原体感染，其形态、大小与猪嗜血支原体相同。A、B、C3组试验香猪在感染后的第5～7天红细胞感染率达到80%，第9～12天红细胞感染率相继达到90%以上，第14天后感染率下降，但一直维持在75%左右；D组东方香猪嗜血支原体呈一过性感染；E组东方香猪无变化。

表3 嗜血支原体感染仔猪体温、呼吸、心率变化情况（平均值）

2.5.2 姬姆萨氏染色检查

试验组香猪血液涂片，姬姆萨氏染色，油镜观察，可见嗜血支原体被染成淡紫色。

2.5.3 血常规检查

感染后第7天采集各组香猪血液做血液常规测定，并应用SPSS软件进行统计学分析，结果见表4。

表4表明，各组东方香猪在感染猪嗜血支原体后，白细胞总数显著升高 （P＜0.01），淋巴细胞总数、红细胞总数、血红蛋白含量均显著下降 （P＜0.05），红细胞比容显著下降 （P＜0.01）。

2.6 东方香猪血清中猪嗜血支原体抗体的检测

将浓度为5μg/ml的猪嗜血支原体提纯抗原包被于酶标板，待检血清稀释倍数为1：100，酶标二抗作浓度稀释倍数为 1：4000，判定标准血清 OD405值≥0.18定为阳性，OD405值≤0.14定为阴性，0.14～0.18之间定为疑似。在感染后的第3、5、7、14、21天，采集每组东方香猪的血清，在上述条件下进行间接ELISA检测，结果见表5。

从图中可以看出，A、B、C3组东方香猪的抗体水平在感染第7天时达最高，D组香猪的抗体水平从3d开始直到21d时一直在升高。说明低免疫力影响东方香猪的抗体水平升高。

表5 东方香猪血清间接ELISA检测结果

3 结论

（1）东方香猪可感染嗜血支原体，其感染率达70%。低免疫力的香猪在人工感染猪嗜血支原体后相继表现出体温升高，精神萎顿，食欲减退；可视黏膜苍白、黄染，个别猪全身皮肤黄染；两耳发绀，耳尖干燥。四肢内侧、胸腹下有大小不同的出血点和紫斑；有不同程度的呕吐、腹泻，消瘦，生长发育迟滞；体温、呼吸、心率均有明显变化，出现了猪嗜血支原体病典型临床症状。

表4 试验组东方香猪感染前后血液常规比较

（2）成功建立了嗜血支原体东方香猪动物感染模型。合适的感染剂量对动物模型建立非常重要，剂量小可能达不到所要求的感染率，而剂量太大则可能造成试验动物死亡，因此感染剂量的多少直接影响到模型建立是否成功。

朴光一 （1966-)，男，高级畜牧师，研究方向：病原和分子生物学。

*通讯作者：金一，教授，主要从事分子生物学研究。