陈明生 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200)

两种兽药残留检测技术的差异比较

陈明生 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200)

面对从出不穷的食品安全问题和溯源管理难等问题，快速检测技术和仪器及试剂的研究具有特殊的意义，应从我国实际出发，尽快形成 “快速筛查方法”和 “确证检测方法”相结合的检测方法体系。借鉴和采用国内外先进技术和经验，研究并实施动物性产品中兽药残留的快速检测技术，目前快速检测技术主要有酶联免疫检测技术、胶体金免疫层技术、微生物抑制法检测技术、化学发光酶免疫检测技术等，也是未来快速检测技术的发展趋势，上述快速检测技术可以满足大量样品检测，缩短检测周期、降低检测费用。

下面就将兽药残留检测技术的研究工作得出的成功经验做一个简单介绍。比对液相—串联质谱法中内标法、外标法，确定内标法为最佳确证法，经确证酶联免疫检测法和胶体金免疫层析法是最适合基层工作的最佳快速检测技术方法，为实验室及现场检测方法的实施提供参考。

以盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇为例，比对检测样品前处理的内标法和外标法检测结果，确定内标法的准确度和精密度更高，是最佳的确定方法。

内标法：是色谱分析中一种比较准确的定量方法，其方法是将一定质量的内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积 （或峰高）及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。

外标法：是以待测成分的对照品作为对照物质，相对比较以求得供试品的含量。是以待测成分的对照品作为对照物质，相对比较已求得供食品的含量。

准确度：指在一定条件下多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。用来表示系统误差大小。在实际工作中，通常用标准物质或标准方法进行对照实验，在无标准物质或标准方法时，常用加入被测定组分的纯物质进行回收实验来估计和确定准确度。

精确度：是在规定条件下，独立测量结果间的一致程度分析时，常用RSD表示精确度。

内标物：将一个已知质量，样品中不含有杂质的纯物质加入到待测样品溶液中，以此纯物质的量为标准，对比测定待测组分的含量，该纯物质称为内标物。

1 内标法

1.1 原理

试料中的残留药物经酶解，用高氯酸调pH值后高速离心沉淀蛋白，上清液调PH值后分别用乙酸乙酯和叔丁基甲醚 （TBME）提取，再用MCX固相萃取柱净化，液相色谱—串联质谱法测定。

1.2 检测步骤

（1）样品的制备：取适量新鲜或冷冻的猪肉组织绞碎并匀质；取适量新鲜或冷冻的牛奶混合均匀；取适量新鲜或冷冻的鸡蛋去壳后混合均匀。

将制备的猪肉、牛奶和鸡蛋样品储存于-20℃以下备用。

（2）制备试料：取匀质的供试料品作为供试试料；取匀质的空白样品作为空白试料；取匀质的空白样品添加适宜浓度的标准工作液作为空白添加试料；在所有的供试试料、空白试料、空白添加试料中都加入等量适宜浓度的内标准工作。

（3）酶解：准确称取均匀样品2g（精致到0.01g）于50ml离心管内加入0.2mol/L乙酸铵溶液 （pH值5.2）8ml，再加入β—盐酸葡萄糖醛苷酶40μL涡旋混匀，于37℃下避光恒温振荡16h。

（4）提取：酶解后放置至室温，涡旋混匀10000r/min高速离心10min，转移上清液于另一50ml离心管中，加入高氯酸溶液5ml，涡旋混匀，用高氯酸调pH至1.0±0.2，10000r/min高速离心10min，转移上清液于另一50ml离心管中，用氢氧化钠溶液调pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15ml涡旋混匀，振荡10min，5000r/min高速离心5min，取上层有机相至另一离心管中，再在下层水相中加入叔丁基甲醚10ml，涡旋混匀振荡10min，5000r/min高速离心5min合并有机相，50℃平行蒸发至干，用甲酸水溶液5ml溶解备用。

（5）净化：MCX固相萃取柱依次甲醇、2%甲酸水各3ml活化，取备用液全部过柱，再依次用2%甲酸水、甲醇各3ml淋洗、抽干。用3%氨水甲醇溶液2.5ml洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，残留物用甲醇—0.1%甲醇溶液 （10+90，v/v）0.2ml溶解，涡旋混匀，样液经0.2μm针孔过滤器过滤后供液相色谱—串联质谱法测定。

（6）液相色谱—串联质谱法条件：色谱柱：BEHC18柱50mm×2.1mm （i.d.）粒度1.7μm。流动相：A相0.1%甲酸乙腈溶液；B相0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱：0～2min，维持4%A； 2～12min， 4%A 线性变化至 60%A； 12～12.1min， 60%A线性变化至4%A；12.1～16min，维持4%A。流速：0.3ml/min。进样量：10μl。柱温：30℃。离子源：电喷雾ESI正离子。扫描方式：多反应监测MRM，然后以30℃/min升至260℃，保持1min， 再以 20℃/min升至 280℃， 保持 2min，直至样品的组分全部流出。

（7）监测离子对：克伦特罗m/z277.1～202.8（定量离子）、 277.1～258.9； 莱克多巴胺m/z302.3～106.7 （定量离子）、302.3～163.8； 沙丁胺醇 m/z240.1～147.7 （定量离子）、 240.1～221.9；氘代克伦特罗m/z277.1～202.8（定量离子）；氘代莱克多巴胺 m/z302.3～106.7（定量离子）；氘代沙丁胺醇 m/z240.1～147.7 （定量离子）。

（8）质谱分析：在上述工作条件下，通过仪器工作软件绘制标准曲线，以色谱峰面积按内标法定量，克伦特罗氘代代克伦特罗为内标物计算，莱克多巴胺以氘代莱克多巴胺为内标物计算，沙丁胺醇以氘代沙丁胺醇为内标物计算。

（9）液相色谱—串联质谱确证：按上述工作条件测定样品和标准工作液，分别计算样品和标准工作液中非定量离子与定量离子峰面积的比值，仅当两者数值的相对标准偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。

（10）准确度：本方法在0.25～26μg/kg添加浓度范围内，用空白添加校准、校正，其回收率范围80～110%。

（11）精密度：本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。

（12）结果判定：“瘦肉精”β—受体激动剂液相色谱—串联质谱检测法检出限为0.25μg/kg、定量限为0.5μg/kg，判定检测结果大于0.5μg/kg时为阳性。

2 外标法

2.1 原理

同内标法。

2.2 监测步骤

（1）样品的制备：同内标法。

（2）制备试料：取匀质的供试料品作为供试试料；取匀质的空白样品作为空白试料；取匀质的空白样品添加适宜浓度的标准工作液作为空白添加试样。

（3） 酶解。

（4） 提取。

（5）净化分别同内标法。

（6）色谱柱、流动相、梯度洗脱、流速、进样量、柱温、离子源、扫描方式分别同内标法，监测离子对：克伦特罗m/z277.1～202.8（定量离子）、277.1～258.9；莱克多巴胺m/z302.3～106.7 （定量离子）、 302.3～163.8； 沙丁胺醇 m/z240.1～147.7 （定量离子）、 240.1～221.9。

（7）质谱分析：在上述工作条件下，通过仪器工作软件绘制标准曲线，以色谱峰面积定量。

（8）液相色谱—串联质谱确证同内标法。

（9）本方法在0.25～2μg/kg添加浓度范围内用空白添加校准、校正，其回收率范围为70～120%。

（10）精密度：本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。

（11）结果判定：同内标法。

3 内标法于外标法进行比对

通过表1、表2可以看出内标法与外标法的衡量指标的差别。

表1 内标法

表2 外标法

4 结论

通过实验室多次实验并进行内标法和外标法对比，证明内标法灵敏度高、定性准确，确定内标法优于外标法，可作为动物产品中 “瘦肉精”β—受体激动剂残留的最佳确证方法，面对大量动物食品，为防止药物残留超标，液相色谱—串联质谱检测法为动物食品中药物残留快速检测 （酶联免疫检测法和胶体金免疫层析法—筛选法）结果提供了有效的确证。