龙冬梅，黄 涛，汤德元，曾智勇，李 达，韦冠东

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究

龙冬梅，黄 涛，汤德元*，曾智勇，李 达，韦冠东

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

日本乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的严重的人畜共患性传染病，日本乙型脑炎病毒的结构蛋白包括C、PrM和E 3种。其中C蛋白主要参与病毒RNA和蛋白之间的相互作用，且具有核定位信号序列，在乙脑病毒中，缺失此序列后C蛋白只在感染细胞的细胞质中出现；PrM和E基因是其主要免疫保护性抗原基因，表达的蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，是病毒颗粒的主要成分，也是维持病毒粒子形态结构的主要物质，主要参与病毒感染的后期阶段，可诱导产生保护性免疫。近年来许多学者对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因原核表达和真核表达及其相关免疫原性进行了大量的研究，取得了一定的研究进展，文章主要针对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究进展进行了综述，为乙型脑炎基因工程疫苗的进一步研究提供参考。

日本乙型脑炎病毒；结构蛋白；原核表达；真核表达；免疫原性

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)简称乙脑，是由乙型 脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) 引起的以三带库蚊为主要传播媒介的严重的人畜共患传染病。该病主要侵犯患病动物或人的丘脑、脊髓、角细胞、大脑皮质和小脑，引起患者中枢神经系统严重损伤。动物感染JEV的死亡率为30%，存活下来的有50%的动物会有神经系统的后遗症［1］。世界卫生组织（WHO）已经把日本乙型脑炎列为重点防控传染病。猪是乙型脑炎的主要传染源，是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，对猪的致死率不高，临床上以高热和狂暴、或沉郁、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激等神经症状为特征，具有明显的季节性和一定的地理区域分布，多发生于蚊虫较多的夏秋季节，属于自然疫源性疾病，可引起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎，也可引起公猪睾丸急性炎症反应或不育，因此，控制猪的乙脑具有十分重要的意义。随着科技工作者对JEV分子结构的大量研究，人们对JEV基因结构和基因表达的蛋白等都有了较为清楚的认识，为从分子水平上来研究JEV的防制奠定了理论基础。在此基础上，近年来许多学者对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因原核表达和真核表达及其相关免疫原性进行了大量的研究，取得了一定的研究进展，本文主要针对日本乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的研究进展进行了综述，为乙型脑炎基因工程疫苗的进一步研究提供参考。

1 日本乙脑病毒的基因组结构

JEV的基因组为单股正链RNA分子，其长度为11 kb，与其他黄病毒科成员相似，整个基因组由非编码区(5'-noncoding region， 5'-NCR )和3’端的非编码区(3'-NCR)和一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框(open reading frame， ORF)构成，无亚基因组结构。5'端有一个I型帽子结构，3’端无Poly ( A)尾，各基因之间无重叠。从5’端至3’端形成3个结构蛋白：核衣壳蛋白C(C)、膜蛋白( PrM/M )、囊膜糖蛋白(E)；7个非结构蛋白(NS1．NS2a．NS2b． NS3．NS4a．NS4b．NS5)，各基因在基因组上的排列为：5"-C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3"，它们之间无重叠，JEV基因组结构示意图如图1。

图1 JEV基因结构示意图

2 JEV蛋白的结构蛋白与功能

JEV有3种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)和囊膜糖蛋白(E)，这些结构蛋白是日本乙型脑炎病毒颗粒的主要成分，是维持病毒粒子形态结构的主要物质，编码JEV结构蛋白的这些基因定位于ORF5’端约前1/3的部分，结构蛋白在N端顺序依次为核衣壳蛋白C、膜蛋白PrM/ M和囊膜糖蛋白E，信号肽酶对此进行至少3次切割，将这些结构蛋白分开。JEV 3种结构蛋白的功能分别为：

2.1 核衣壳蛋白C

核衣壳蛋白C的分子量为13 ku，属于强碱性蛋白，由136个氨基酸组成，其39～54位氨基酸序列在黄病毒属中具有保护性，且该段氨基酸序列具有疏水性［2］。C蛋白的保守性稍差，主要作用为C蛋白与基因组RNA结合组成核心，参与病毒RNA和蛋白之间的相互作用，将其暂时固定在宿主细胞的内置网上，在病毒和衣壳装配时发挥作用，作用是在合成部位由C端疏水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上，以便装配成核衣壳包裹基因组，保护基因组免受核酸酶或其他因素的破坏。

2.2 M蛋白

M蛋白是由其前体PrM切割而产生，分子量为8．5 ku，约含有75个氨基酸残基，具有高度的疏水性，参与病毒囊膜的构成，被包埋在病毒粒子囊膜的脂质双层中，它可能与插入脂双层中的E蛋白完全疏水性C端相互作用。其前体蛋白PrM(18～19 ku)存在于感染细胞内未成熟毒粒中，是未成熟病毒体的一部分，病毒以此与细胞相连。在病毒感染后期，可以诱导保护性免疫，PrM蛋白紧密地与E蛋白结合在一起，形成异二聚体，其作用认为是伴侣蛋白PrM对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配起着至关重要的作用，是与膜结合以及装配时所必须的，抑制病毒的作用直到病毒释放。Takegami等［3］在对其生物学功能的研究中认为：M蛋白参与病毒的感染过程，能诱生具有轻度中和作用的抗体。PrM区整体结构相对较稳定［4］，是病毒诱发保护性免疫的重要协同成分，对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配十分重要。

2.3 包膜蛋白E

E蛋白是JEV主要的囊膜蛋白，也是毒粒表面最重要的成分，在JEV毒力中占有重要位置，分子量为53 ku，含有病毒血凝素中和抗原决定簇，为黄病毒属中的主要结构蛋白，是引起宿主机体免疫及产生中和抗体的主要抗原蛋白，它在参与病毒粒子的吸附、穿入、致病和诱导宿主的免疫应答等密切相关，在诱导机体产生有效的中和抗体及其保护性免疫中起重要作用［5］，并且是体外中和作用中的主要靶位点和JEV特异性抗体的作用位点，一般认为E蛋白是病毒受体的结合蛋白，介导膜融合和细胞传入。基因为单位点突变可使JEV病毒丧失其神经毒力/侵袭力，通过对减毒株和野毒株的比较共有8个氨基酸残基差异，具体位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439位，是毒力减弱的关键位点，其中E138和E176位点上的氨基酸突变可能改变E蛋白对细胞受体的吸附性，或者引起该病毒对其他细胞不可穿透，这两种机制导致病毒毒力减弱，即E蛋白138位点或138和176位点一起对乙型脑炎病毒强毒株在连续传代过程中减弱起了关键作用［6］。同时E蛋白是体外中和作用的主要靶位点和JEV特异性抗体的作用位点，可激发中和抗体和保护性免疫。

3 日本乙型脑炎病毒保护性抗原表达及其免疫的研究进展

3.1 日本乙型脑炎的原核表达的研究进展

Mason等［7］己成功地在大肠杆菌中表达JEV的 E蛋白，对其进行单抗结合位点的研究。Konish等［8］用高度致弱的痘苗病毒NYVAC株分别构建了VP908和VP923；VP908表达PrM、E和NS1， VP923表达PrM和E，用VP908和VP923免疫猪，能明显降低JEV强毒株攻击后的病毒血症。

Wu等［9］将JEVCH2195LA分离株的E蛋白这段目的基因克隆到原核表达载体pET32a，然后在大肠杆菌中表达融合蛋白TrxD3，用纯化的蛋白与弗氏佐剂或阳离子脂质混合后免疫小鼠，结果证明：TrxD3融合蛋白能够使小鼠产生较高的免疫保护中和抗体。

谢良伊［10］等根据GenBank数据库中乙型脑炎病毒的PrM氨基酸序列获得其对应的基因序列，对PrM全长基因（80aa）进行体外合成，将其克隆至Pet-21原核表达载体，构建重组表达质粒Pet21-PrM，将阳性重组质粒转化大肠杆菌，IPTG诱导表达融合蛋白，通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白，将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠，获取克隆抗体并利用Protein A Sepharose柱进行纯化，然后用ELISA法检测抗体的效价，再用Western bolt法检测抗体的特异性，最后获得了高纯度的乙型脑炎病毒PrM蛋白，并成功地制定了效价高达1：1．6×106特异性的单克隆抗体。

梅匀安等［11］提取JEV上海分离株的基因组RNA，反转录合成cDNA，RT-PCR扩增该病毒的PrM基因片段，亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上，构建重组质粒pET-28(a)-JEV-prM并转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取克隆扩大培养3 h后，1 mmol/LIPTG诱导3 h，分别在诱导前和诱导后取样，煮沸裂解细菌，SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况，结果表明获得分子量为24 ku的重组蛋白，主要以包涵体形式表达，薄层扫描分析表明：表达量占总菌体蛋白的30%以上，纯化后获得高纯度重组蛋白，占总蛋白60%以上。用纯化蛋白His-JEV-prM免疫BALB/ c小鼠，制备了小鼠抗JEV-prM抗体，Western-blotting和间接免疫荧光检测小鼠抗JEV-PrM抗体的特异性。纯化蛋白能诱导小鼠产生高滴度抗体，并且该抗体能特异识别原核、真核和病毒表达的PrM。

徐健等［12］和汤德元等［13］将收集到的JEV贵州分离株（GZ株）根据GenBank登录的JEVSA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物，用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因，并将E基因克隆到pET-32a-E(+）原核表达载体上，成功地构建出了JEV的 E基因原核表达质粒pET-32a-E，将构建好的原核表达质粒转化至宿主菌BL21(DH3）中，诱导表达目的蛋白，表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析，得到了约59 ku条带，与预期大小相符，进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白，并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠，免疫后采血检测抗体。结果显示：JEV贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平。

3.2 日本乙型脑炎病毒的真核表达的研究进展

Ashok M S等［14］构建了编码JEV E蛋白的DNA质粒PCM XENV，经鼻腔和肌肉途径接种瑞士小鼠后，进行JEV脑内接种攻击试验，结果显示：该重组质粒对攻击感染有一定的保护作用。

Chen等［15］利用真核表达载体分别重组构建了JEV E蛋白以及其他蛋白基因片段，通过比较上述重组质粒在分别免疫动物后所产生的中和抗体效价与免疫保护效果，发现含JEV E蛋白编码基因的质粒DNA所致的中和抗体效价以及保护性免疫结果明显优于其他蛋白基因片段，用编码JEV E蛋白的质粒免疫小鼠，与活疫苗比较，结果产生了更持久更强的JEV E蛋白特异性抗体，且对JEV的致死具有高度保护性作用。

Konishi［16］利用DNA重组技术分别克隆了JEV E、C、NS1-2A、NS3以及NS5等蛋白编码基因片段，发现含有JEV E蛋白编码基因的质粒DNA所致的中和抗体效价以及保护性免疫结果明显优于其他基因片段，说明含JEV E蛋白编码基因的质粒DNA免疫结果与前述E蛋白功能分析相符合，在诱导机体产生中和抗体和保护性免疫方面起着主要作用。研究还发现：含JEV PrME蛋白编码基因的重组质粒DNA在免疫动物后不仅诱导出特异性的CTL细胞免疫反应，而且还能产生特异性B细胞来参与体液反应，通过进一步研究还发现在免疫动物体内产生的中和抗体的效价与维持所需的时间都明显高于普通灭活苗的免疫效果［17］。

Kour R等［18］用合成分泌型或膜锚定型JEV的P rM和E蛋白的质粒经肌注或基因枪接种小鼠发现：E蛋白的2种表达类型均能诱导较高的中和抗体滴度，而肌注较基因枪方法能诱导更高水平的抗E抗体反应；认为肌注可能诱导以Thl为主的免疫反应，而基因枪接种诱导Th2为主的免疫反应；在小鼠对JEV脑内接种的攻击感染可提供60%的保护。

冯国和［19］等提取JEV野生株JaGAr-01感染培养的C6/36细胞的总RNA，经RT-PCR方法扩增出JEV prM/E与E基因片段，经电泳和核酸测序后分别将它们的蛋白编码基因片段构建于真核表达载体pcDNA3的BamHI/EcoR I酶切位点之间，并分别将其命名为pJME和pJE。对培养后采用脂质转染技术，选用HepG2、COS-1、KN73细胞作为受体细胞，将已构建的重组质粒pJME和pJE分别转染于受体细胞，采用不同抗体系统，经Western blot法检测JEV prME和E蛋白的表达特征，结果发现：在不同的细胞系内，PrM/ E蛋白的表达优于E蛋白。

4 对乙型脑炎病毒保护性抗原基因表达的展望

根据乙型脑炎病毒保护性基因的原核表达，抗原结合黄病毒C至E区段各结构蛋白功能特点分析，人们发现在prM和E蛋白编码基因所进行的DNA疫苗具有一定的代表性。目前，国内外应用的乙脑疫苗主要有灭活疫苗和减毒疫苗2种。灭活疫苗主要是鼠脑纯化灭活疫苗、和地鼠肾细胞灭活疫苗。鼠脑纯化灭活疫苗是从感染鼠脑培养制备的，由日本研制生产并得到国际广泛认可和使用的疫苗；地鼠肾细胞灭活疫苗为我国生产，病毒经原代地鼠肾细胞培养制备的疫苗，1998年开始生产使用，随后在全国大面积使用。近几年，Vero细胞纯化灭活疫苗已在研究生产，该疫苗主要是我国自主研制的乙脑SA14-14-2株，为目前唯一获得认可和推广使用的乙脑活疫苗，自1989年获得新药证书以来，该疫苗产量不断增多，并在全国广泛使用，其弱毒性稳定并己经得到世界卫生组织的认可［20］；2000年曾明等对该减毒活疫苗进行了基因组全序列测定，证明了它传代后的稳定性。随着分子免疫学、分子生物学的迅猛发展和生物技术的进步和对JEV的分子生物学的大量研究，目前预防乙型脑炎病毒感染的疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗，但由于灭活疫苗存在注射量大，需要多次注射，且效果不稳定、免疫力不持久以及副作用大等缺点，所以减毒苗是一个更好的选择；但是活疫苗毕竟是一种活的生物，所以我国研制的SA14-14-2株减毒活疫苗也会出现毒力返强、带毒、排毒、垂直传播和核酸重组等现象，而且通过常规的血清学方法一般无法与自然感染区分开，所以基因工程苗是乙脑疫苗发展的方向，国内外学者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白质疫苗和亚病毒颗粒疫苗方面取得了一些进展。如用乙脑SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黄热病毒cDNA的相应序列，构建了嵌合的减毒乙脑疫苗，免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保护作用［20］。基因工程疫苗有良好的发展前景，但有很多实际问题尚需解决。

［1］ 殷震，刘景华．动物病毒学［M］．2版．北京：科学出版社，1997：631-640．

［2］ DEUBEL V， KINNEY R M，TRENT D W． Nucleotide sequence and deduced amino acidsequence of the nonstructural proteins of dengue type 2 virus， Jamaica genotype：comparative analysis of the full-length genome［J］．Virology，1988，165(1)： 234-244．

［3］ TAKEGAMI T， MIYAMOTO H，NAKAMURA H， et al． Differences in biological activity ofthe V3 envelope protein of two Japanese encephalitis virus strains［J］． Acta Virol， 1982，26151： 321-327．

［4］ 徐可树，李琪，王华枫，等．乙脑病毒持续感染株preM区序列分析［J］．中国病毒学，2006， 21(4)： 309-313．

［5］ TANG D Y，LIU J，WANG F，et al． Isolation and molecular characterization of Japaneseencephalitis virus ZG strain from piglets， China［J］．African Journal of Microbiology Research，2013，7(2)：89-97

［6］ JIAL， WANGZ， YUY，et al． Protection of SA14-14-2 live attenuated Japanese encephalitisvaccine against the wildtype JE viruses［J］． Chin Med J (Engl)， 2003， 116(6)： 941-943．

［7］ MASONPW． Maturation of Japanese encephalitis virus glycoproteins produced byinfected mammlian andmoscluito cells ［J］．Virology， 1989， 169：354-304．

［8］ KONISHI E， PINCUS S， PAOLETTI E，et al． A highly attenuated host range-restricted vaccinia virus strain，NYVAC， encoding the PrM， E， and NS 1genes of Japanese encephalitis virus prevents JEV viremia in swine［J］．Virology， 1992 ，190(1)：454-458．

［9］ 吴有强，熊曦明，曾君祉，等．抗乙型脑炎病毒单克隆抗体重链可变区基因在烟草中的表达［J］．科学通报，1997，42(11)：1205-1208．

［10］ 谢良伊，曹友德，谭黎明，等． 乙型脑炎病毒PrM蛋白原核表达及单克隆抗体制备［J］． 中国现代医学杂志，2014(33)6-10．

［11］ 梅匀安，袁庄川，韩秀杰，等．日本脑炎病毒prM蛋白的表达及免疫原性分析［J］． 畜牧与兽医，2014，46（9）：76-80．

［12］ 徐健，汤德元，李春燕，等．乙型脑炎病毒贵州株的分离鉴定与E基因原核表达的研究［D］．贵阳：贵州大学，2011．

［13］ 汤德元，王凤，马萍，等． 乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究［J］．畜牧兽医学报．2012，43(8)：1330-1336．

［14］ ASHOK M S，RANGARAJAN P N．mmunration with plasmid DNA encoding the envelope glycoprotein of Japanese Encephalitis virus Confiers significant protection against in tracerebral viral challenge without inducing detectable antiviral antibodies［J］．Vaccine，1999，18 (2)：68-75．

［15］ CHEN H W，PAN C H，LIAU M Y，et al． Screening of protective antigens of Japanese encephalitis virus by DNA immumzation：a comparative study with conventional viral vaccines［J］． J Virol，1999，73(12)：10137-10145．

［16］ KONISHI E，YAMAOKA M， WIN K S，et al． Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encephalitis virus premembrane and envelope genes［J］．J Virol，1998，72(6)：4925-4930．

［17］ KONISHI E，YAMAOKA M，WIN K S，et al． The anamnestic neutralizing antibody response is critical for protection of mice from challengefollowing vaccination with a plasmid encoding the Japanese encephalitis virus premenbrane and envelope genes［J］． J Virol，1999，73(7)：5527-5534．

［18］ KOUR R，SACHDEVA G，VRATI S． Plasmid DNA immunization against Japanese encephalitis virus：immunogenicity of membrane-anchored and secretory envelope protein［J］．Infec Dis，2002，185(1)：1-12．

［19］ 冯国和．乙脑病毒prME与E蛋白编码基因的构建、表达及DNA免疫的研究［D］． 北京：中国医科大学，2002．

［20］ 俞永新．流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA(14 )-14-2弱毒株的表 型和基因型特性及其稳定性［J］．中国计划免疫2002，8(5)：283-287．

2016-01-28）

贵州大学引进人才科研项目（2015）。

龙冬梅（1990-），女，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子病毒学的科研学习。

*通讯作者：汤德元（1964-），男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。E-mail：tdyuan@163.com