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时差成像技术在常规体外受精周期中单原核胚胎的原核形成和卵裂模式及对其发育潜能的应用

2015-11-28王珊珊蒋益群张宁媛孙海翔

中国医药导报 2015年32期
关键词:轴性卵裂原核

招 霞 王珊珊 蒋益群 张宁媛 孙海翔

南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心,江苏南京 210008

时差成像技术在常规体外受精周期中单原核胚胎的原核形成和卵裂模式及对其发育潜能的应用

招 霞 王珊珊 蒋益群 张宁媛 孙海翔▲

南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心,江苏南京 210008

目的 通过时差成像系统(TLI)观察常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中单原核胚胎的发育特征,探讨原核形成方式、卵裂模式与囊胚形成的关系,评估单原核胚胎的发育潜能。 方法选取2013年10月~2015年3月在南京鼓楼医院生殖医学中心行常规体外受精(IVF)周期患者的单原核胚胎的175个周期胚胎行TLI动态观察,对其中228个单原核胚胎进行囊胚培养,回顾性分析胚胎的原核形成方式、卵裂模式和囊胚形成结局。 结果原核形成方式上,10.09%(23/228)的胚胎的单原核为2个原核融合而成,其他胚胎始终只观察到1个原核。卵裂模式上,21.93%(50/228)胚胎卵裂模式正常,异常的卵裂模式包括非轴性卵裂、不均卵裂、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂、发育停滞及未卵裂,其中非二倍性卵裂和卵裂球碎裂较为多见,17.11%(39/228)单原核胚胎有可移植囊胚评分>ⅣCC,7.46%(17/228)的胚胎形成的囊胚评分≥ⅣBB。原核形成方式上,2个原核融合为1个原核的单原核胚胎的可移植囊胚形成率显著高于始终为1个原核者;卵裂模式上,可移植囊胚均来源于卵裂模式正常及仅发生非轴性卵裂的胚胎,其可移植囊胚形成率分别为66.00%和46.15%,而其他卵裂模式异常的胚胎无可移植囊胚形成。结论常规IVF周期的单原核胚胎具有一定的发育潜能,单原核胚胎的发育潜能与其原核形成方式和卵裂模式密切相关,2个原核融合为1个原核的单原核胚胎和卵裂模式正常者及仅发生非轴性卵裂者具有较高的可移植囊胚形成率。当患者无可移植的双原核胚胎时,可将2个原核融合为1个原核的单原核胚胎纳入选择范围,卵裂模式亦有助于筛选具有发育潜能的单原核胚胎,对正常及仅发生非轴性卵裂的单原核胚胎进行移植或冷冻,以提高卵子利用率。

单原核胚胎;时差成像;原核形成;卵裂模式;体外受精;胚胎发育

在体外受精-胚胎移植 (in-vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)周期中,观察常规体外受精(IVF)或卵子胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后的卵子在受精后16~18 h的状态,具有两个原核为正常受精,而多个原核和单原核被认为是异常受精。异常受精的胚胎由于染色体可能存在异常而容易导致胚胎着床失败和自然流产,一般不用于移植,降低胚胎利用率。IVF和ICSI后单原核胚胎的发生率为3%~6%[1],单原核胚胎是否具有发育潜能,能否用于移植或冷冻尚无定论。研究显示[2-4],常规IVF周期中48.7%~61.9%的单原核胚胎为二倍体,提示常规IVF周期中单原核胚胎具有一定的可利用价值。

近来研究发现,胚胎发育的动态参数与胚胎活力和染色体是否正常有关,可用来评估胚胎质量,预测其发育潜能。而某些动态参数在传统观察方式下无法记录,近年兴起的时差成像系统(time-lapse imaging,TLI)将摄像装置与培养箱结合,在培养箱内每间隔一定时间对胚胎进行自动摄像,形成胚胎发育全过程的动态影像。TLI克服了传统胚胎观察的弊端,在保证胚胎培养环境稳定的同时,对胚胎发育进行更加全面和细致的记录。一些与胚胎发育潜能密切相关的生物学特征,如原核的形成及消失、卵裂时间及同步性等已经帮助胚胎学家更为有效地评价胚胎质量。Meseguer等[5]大样本回顾性研究证明,应用TLI观察的动态参数挑选胚胎与传统方法相比临床妊娠率可提高约20%。目前对TLI技术应用于胚胎评估的研究主要集中于时间参数[6-7]。Athayde等[8]研究表明,TLI可以识别形态学正常而卵裂模式异常的胚胎,如1个卵裂球直接分裂为3个卵裂球的异常卵裂,而非整倍体或基因异常是诱发胚胎异常卵裂的主要原因,如将此类胚胎进行移植,可导致流产率升高,提示卵裂模式对胚胎发育结局具有重要影响。

本研究将常规IVF周期患者的胚胎通过TLI系统进行培养和观察,对其中单原核胚胎培养至囊胚期,回顾性分析其卵裂模式和囊胚形成情况的关系,以此评估卵裂期单原核胚胎的发育潜能,指导临床患者单原核胚胎的利用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究于2013年10月~2015年3月在南京鼓楼医院生殖医学中心(以下简称“我院”)进行,对有单原核胚胎的175个周期资料进行回顾性分析。患者纳入标准:①常规IVF周期;②女方年龄≤40岁;③周期数≤2;④月经第3天促卵泡激素(FSH)≤12 U/mL;⑤常规长方案促排卵[9];⑥获卵数为5~15。患者排除标准:①完全或部分受精失败;②卵子异常。采用短时受精,去除颗粒细胞后置于TLI中,培养至囊胚期。将受精后16~18 h原核数目为1个的单原核胚胎作为研究对象,记录其原核形成方式、卵裂模式及囊胚形成情况。本研究通过我院伦理委员会 (No.2013068)审批,所有患者夫妻双方签署知情同意书。

1.2 TLI系统

本研究采用Primo Vision TLI(Vitrolife,Sweden)时差成像系统[10],此系统在传统培养箱内配置倒置胚胎显微镜,通过数据线与培养箱外的控制台主机相连接,胚胎置于专用9孔集合培养皿中培养,每孔放置1个胚胎,具有明确的位置标记,拍照频率为5 min/次,直至胚胎发育至第6天。

1.3 IVF与胚胎培养

卵子取出后置于IVF(Vitrolife,瑞典)培养微滴中,37℃、6%CO2的培养箱中培养。获卵3 h后加精,加精比例为10 000条精子/卵子。采用短时受精方法,精卵共孵育6 h后机械剥离颗粒细胞,置于倒置显微镜下观察第二极体是否形成,以判断卵子是否受精。受精卵子数目超过总卵数60%的患者被认为受精成功。患者胚胎在判断受精成功后即转入含有G1(Vitrolife,瑞典)培养液的WOW培养皿中,置于TLI系统中进行胚胎培养和观察。第3天胚胎移植后,其余胚胎按照相同位置转入含有G2(Vitrolife,Sweden)的WOW皿中进行囊胚培养至第6天。

1.4 囊胚分级

对形成囊胚者根据ALPHA/ESHRE指南对其质量进行分级[11]。根据囊胚的扩张和孵出程度将其分为Ⅰ~Ⅵ级,根据内细胞团(inner cell mass,ICM)和滋养层(trophectoderm,TE)的质量分为A~C级。本研究中在第5天或6天将囊胚分级>ⅣCC者定义为可移植囊胚,≥ⅣBB者定义为优质囊胚。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差()表示,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胚胎观察及其卵裂模式的定义

通过TLI动态观察单原核胚胎发育,记录胚胎的卵裂模式。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂和异常卵裂,其中异常卵裂模式包括不均、非轴性卵裂、非二倍性卵裂、发育停滞及卵裂球碎裂。见表1。

2.2 患者一般资料与胚胎发育情况

在175个周期中观察到单原核胚胎共228个。患者年龄为(31.75±3.21)岁,体重指数为(22.54±3.02)kg/m2,基础FSH为(6.89±1.84)mU/mL,平均获卵数为(10.96± 3.17)个,正常受精率为72.71%,正常卵裂率为98.55%,可移植囊胚形成率为17.11%,优质囊胚形成率为7.46%。

表1 胚胎主要的异常卵裂模式定义及图示

2.3 单原核胚胎原核形成方式与囊胚形成

少部分单原核胚胎的1个原核为2个原核融合而成,大部分胚胎始终只观察到1个原核。单原核直径在22~32 μm,平均(27.13±2.54)μm。在原核后期原核直径增大,之后消失。原核由2个原核融合而成的单原核胚胎与始终只有1个原核的胚胎相比,具有较高的可移植囊胚形成率及优质囊胚形成率,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

1个单原核胚胎的原核由2个原核融合而成,胚胎在原核形成初期为2个原核,之后两个原核相互靠近融合,在受精16~18 h观察时,表现为1个原核。此胚胎分裂模式和发育速度同双原核胚胎,即从受精卵分裂为2个细胞,在第2天发育为4个细胞,在第3天发育为8个细胞,在第5天发育为囊胚。见图1。

表2 单原核胚胎原核形成方式与囊胚形成[n=228,n(%)]

2.4 单原核胚胎卵裂模式与囊胚形成

图1 单原核胚胎的发育

单原核胚胎中,少部分胚胎卵裂模式正常,大部分胚胎卵裂模式出现异常,其中非二倍性卵裂和卵裂球碎裂较为多见,其次为发育停滞和未卵裂,再次为非轴性卵裂和不均卵裂。可移植囊胚仅来源于卵裂模式正常及发生非轴性卵裂的胚胎。卵裂模式正常的胚胎可移植囊胚形成率和优质囊胚形成率最高,其次为仅发生非轴性卵裂的胚胎。而不均、非二倍性卵裂、发育停滞及卵裂球碎裂这些卵裂模式异常的胚胎无可移植囊胚形成。见表3。

表3 胚胎卵裂模式与囊胚形成[n=228,n(%)]

3 讨论

受精是精卵相互协调发育的复杂过程,是辅助生殖技术中的首要环节。卵子取出后停滞于第2次减数分裂的中期,待精子进入后继续减数分裂,排出含有染色质的第二极体,继而出现分别来自母方和父方的两个原核,这是正常受精的标志。原核的形成可发生在受精后3~20 h,大部分正常受精的合子在受精后16~18 h表现为两个原核。这个结论是基于卵子是成熟的,在受精时已完成第1次减数分裂。然而,有些卵子可能是正常受精,但是由于成熟过程延迟而表现为无原核或单原核[12]。单原核来源的胚胎能否用于移植一直为胚胎学家所困扰,目前单原核胚胎通常不作为移植胚胎的首选。

在早期IVF工作中,单原核合子被认为是由化学、机械刺激引起的孤雌生殖,而非精子进入的受精,卵胞浆内精子注射(ICSI)术后的单原核多是这一来源,机械刺激激活了卵母细胞。然而,随着基因检测技术的发展,在单原核合子中检测到Y染色体的存在,证实单原核的胚胎有受精的发生,这在常规IVF周期中较为常见。Porter等[13]应用荧光原位杂交技术对常规IVF来源的单原核胚胎进行检测,结果显示54.35%胚胎为二倍体,且50%有Y染色体,这个结果远高于ICSI来源的单原核胚胎 (10%~34.62%)。Staessen等[3]与Sultan等[4]得到了与Porter等[13]相似的结果,IVF中单原核胚胎的二倍体比例为48.7%~61.9%。除了孤雌生殖,目前认为单原核的形成机制包括:雌雄原核发育的非同步性,导致两个原核形成或消失不一致,当在某一时间点观察时,仅见单个原核存在、雌雄原核形成障碍及雌雄原核的异常融合[14]。后者包括雌雄原核形成一个共用的核膜或者在原核形成之初为两个原核,之后融合成大的单个原核。有些单原核合子由于核膜结构异常,始终没有第二原核出现。囊胚培养是对胚胎染色体状态进行自然筛选的有效方法[15],对于人类胚胎,胚胎基因组决定胚胎形成8个细胞之后的发育。如果胚胎染色体正常,胚胎基因组正常激活,则胚胎在8个细胞之后顺利发育到囊胚阶段的可能性较高。因此,囊胚形成与否及其质量反映了胚胎的染色体状态和发育潜能。研究表明二倍体的单原核胚胎发育成囊胚的比例较高,我院生殖医学中心数据显示[16],女方年龄<35岁的常规IVF周期中,单原核胚胎≥ⅣBC囊胚的形成率为11.90%。目前有移植单原核胚胎分娩出健康新生儿的报道[17-18],因此认为IVF单原核胚胎具有一定的可利用价值。

在IVF临床工作中,对于无双原核来源的优质胚胎可用的患者,如果将优质单原核胚胎加以利用,可避免周期取消,提高卵子利用率。怎样预测单原核胚胎的发育潜能,在不破坏胚胎的前提下最大限度地排除染色体异常的胚胎是目前亟待解决的问题。目前胚胎的观察和筛选大多采用传统的胚胎观察方式,即在胚胎发育的数天中仅在某几个时间点对胚胎进行观察,其中原核的形成、消失、胚胎的卵裂模式等动态信息仅通过片面的静态的胚胎形态观察无法得知。近年来兴起的IFN系统可在稳定可控的环境中对胚胎发育进行高频率的观察和记录,形成胚胎发育的连续影像。应用这种先进的胚胎观察模式,我们可捕捉胚胎发育过程中的动态变化,通过分析胚胎的发育特征,寻找与囊胚形成具有密切关系的动力学参数,对于预测胚胎的发育潜能具有重要的指导意义。

本研究将单原核胚胎培养至囊胚阶段,囊胚形成结果显示单原核胚胎整体可利用率为17.11%。为进一步预测胚胎发育潜能,笔者应用TLI系统对胚胎的发育特征进行动态观察和分析,发现单原核胚胎的囊胚形成与其原核形成方式及卵裂模式密切相关。原核形成方式上,2个原核融合为1个原核的单原核胚胎的可移植囊胚形成率和优质囊胚形成率显著高于始终为1个原核的单原核胚胎,说明2个原核融合为1个原核的单原核胚胎拥有雌雄2个原核的比例较高,从而具有较高的发育潜能。传统的原核观察仅在受精后16~18 h对原核观察1次,无法判断单个原核是否为2个原核融合而成,TLI系统的应用则有助于观察原核的形成方式和动态变化,识别原核的真正个数,进而预测胚胎的囊胚形成情况和发育潜能。在卵裂模式上,只有卵裂模式正常及仅有非轴性卵裂的胚胎有发育为可移植囊胚的可能,其可利用比例分别为66.00%和46.15%。卵裂模式异常包括不均、非二倍性卵裂、发育停滞及卵裂球碎裂的单倍体胚胎无可移植囊胚形成。不均在胚胎发育中的较为常见,有研究显示[19-20],不均胚胎的非整倍体率和卵裂球多核率显著高于均一胚胎(29.4%比8.5%、21.1%比2.1%)。胚胎非二倍性卵裂可能与染色体异常相关[21],Athayde等[22]发现此类胚胎具有较低的囊胚形成率(11.7%)及种植率(3.7%)。发育停滞的胚胎亦多为非整倍体胚胎[23],发育潜能低下,以上均与本研究结果一致。

综上所述,单原核胚胎具有一定的发育潜能,原核的形成方式和胚胎的卵裂模式与其发育潜能相关。传统的胚胎观察方法无法对以上现象做出观察,而应用TLI系统可通过记录胚胎的原核形成方式和胚胎的卵裂模式预测胚胎的发育潜能。2个原核融合为1个原核的单原核胚胎和卵裂模式正常及仅发生非轴性卵裂的单原核胚胎具有较高的可移植囊胚形成率。对于获卵数较少或该周期中没有可移植的双原核胚胎患者,可通过TLI系统的观察,将2个原核融合为1个原核的单原核胚胎纳入选择范围。TLI系统观察到的卵裂模式亦有助于筛选具有发育潜能的单原核胚胎,选择卵裂模式正常及仅发生非轴性卵裂的单原核胚胎进行移植和冷冻,以提高卵子利用率。发育潜能较好的单原核胚胎与双原核胚胎在染色体和基因上的正常率有无差异,尚需进一步研究证实。

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Study of the pronucleus formation and cleavage pattern of embryos de-rived from mononuclear oocytes after conventional in-vitro fertilization by time-lapse imaging and evaluation of the developmental potential

ZHAO Xia WANG Shanshan JIANG Yiqun ZHANG Ningyuan SUN Haixiang▲
Department of Reproductive Medicine Center,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School,Jiangsu Province,Nanjing 210008,China

Objective To observe the developmental characteristic of embryos derived from mononuclear oocytes after conventional in-vitro fertilization (IVF)by time-lapse imaging(TLI),investigate the relationship of the pronucleus formation,the cleavage patterns and formation rates of blastocyst,and evaluate the developmental potential of mononuclear oocytes.Methods A retrospective study was performed to analyze the 228 mononuclear oocytes embryos of 175 conventional IVF treatment cycles using TLI from October 2013 to March 2015 in Reproductive Medicine Center of the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School.The pronucleus formation,cleavage patterns and blastocyst formation were analysed.Results There were 10.09%(23/228)embryos whose mononuclear were formed by the fusion of two pronuclei.The other embryos remained mononuclear throughout.21.93%(50/228)embryos had normal cleavage pattern.The abnormal cleavage patterns included non-axial cleavage,uneven cleavage,non-diploid cleavage, fragmented blastomere,developmental arrest and no cleavage,among which non-axial cleavage and fragmented blastomere were more common.17.11%(39/228)embryos derived from mononuclear oocytes formed good-quality(>ⅣCC),7.46%(17/228)embryos formed blastocyst whichgrade reached or were greater thanⅣBB.The embryos whose mononuclear was formed by the fusion of two pronuclei have higher transferable blastocyst formation rates than the embryos remained mononuclear throughout.All the transferable blastocysts were developed from mononuclear oocytes with normal cleavage or non-axial cleavage,which the transferable blastocyst formation rates were 66.00%and 46.15%individually.Embryos with other abnormal cleavages had no transferable blastocyst formation.Conclusion Part of embryos after conventional IVF derived from mononuclear oocytes have the chance of forming blastocyst,the developmental potential is closely related to their pronucleus formation and cleavage patterns.Embryos whose mononuclear are formed by the fusion of two pronuclei and embryos with normal cleavage or non-axial cleavage have higher transferable blastocyst formation rates.When there are no good embryos derived from two pronucleus oocytes for transfer,the embryos whose mononuclear are formed by the fusion of two pronuclei can be considered.Cleavage pattern helps to distinguish the potentiality of embryo development.The mononuclear oocytes embryos with normal cleavage or non-axial cleavage can be selected for transplantation or cryopreservation to improve the utilization rate of oocytes.

Mononuclear oocytes;Time-lapse imaging;Pronucleus formation;Cleavage pattern;In-vitro fertilization; Embryo development

R329.1

A

1673-7210(2015)11(b)-0074-06

2015-06-25本文编辑:关 婧)

江苏省省级条件建设与民生科技专项资金项目(BL2014003)。

▲通讯作者

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