刘剑 张磊 王凯 惠浩 代鹏 海璐明 饶维 费舟* (第四军医大学: 西京医院神经外科, 药学系药物基因组学教研室，陕西 西安 7003)

GSI对机械性损伤的神经元保护作用

刘剑1张磊1王凯1惠浩1代鹏2海璐明2饶维1费舟1*
(第四军医大学:1西京医院神经外科,2药学系药物基因组学教研室，陕西 西安 710032)

目的探讨γ-分泌酶抑制剂(GSI)对神经元机械性损伤的保护作用。方法原代培养小鼠皮层神经元，培养基中加入10 μmol/L GSI共同孵育24 h后，使用微量移液器枪头做机械性划伤。测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力的变化；Hochest染色测定神经元凋亡情况；Western blot方法检测切冬酶-3(caspase-3)蛋白表达情况。结果GSI预处理可抑制因细胞损伤引起的LDH的释放，可降低损伤后Hochest阳性细胞的数量以及活化caspase-3的表达。结论GSI对神经元机械性损伤有保护作用。

神经元; 损伤; 凋亡

Notch信号通路是一条细胞间保守的信号转导途径，在大量的组织和器官的早期发育过程中发挥重要作用，对细胞的发育，生长及凋亡起着重要的调控作用[1]。Notch受体的激活和作用需要由依赖早老素1的γ-分泌酶对其进行酶解而释放活化的胞内域(Notch receptor intracellular domain, NICD)，NICD与相应的分子结合后激活下游的信号分子而产生效应[2]。γ-分泌酶抑制剂(gamma-secretase inhibitor, GSI)可以有效的抑制早老素1/γ-分泌酶的复合体，从而明显的抑制Notch信号通路的活化[3]并增强干细胞的分化[4]。近年来的许多细胞层面Notch信号通路研究都使用了GSI[5,6]。目前对Notch信号通路在创伤性脑损伤中的作用研究较少。因此，我们旨在探讨抑制γ-分泌酶调节Notch信号通路与神经元机械性损伤的关系，为创伤性脑损伤的保护机制研究及其应用提供实验依据。

材料与方法

一、材料

妊娠15～16 d昆明孕鼠(第四军医大学动物中心)；多聚赖氨酸、GSI(Sigma公司)；神经元培养基(Gibico)、B27、谷氨酰胺3 mg/l；青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml、乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成)；细胞凋亡Hochest 33258染色试剂盒、兔抗鼠激活型caspase-3一抗(Cell Signal公司)；兔抗鼠caspase-3一体(Cell Signal公司)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)抗兔二抗(Santa Cruz)。

二、方法

1.细胞培养：15～16 d昆明孕鼠，脱颈处死。75%酒精浸泡消毒10 min，在超净台内，无菌条件下打开腹腔，取出胚胎，解剖显微镜下剥出大脑，分离皮层，在显微镜下剥去皮层的脑膜。用眼科剪将皮层剪碎，在胰酶中消化15 min，含20%胎牛血清的细胞培养基(dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)中洗两次，在添加有B27、谷氨酰胺，双抗的神经元培养液中吹打，经血球计数板细胞计数后，调整细胞密度，以1×109/L的密度接种于事先用多聚赖氨酸包被过夜的60 mm培养皿内，置37℃的5%CO2孵箱内培养。每隔3 d半量换液。

2.实验分组、药物与损伤处理：培养6 d的海马神经元随机分为3组，即对照组：正常培养；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)组：按10 μmol/L的终浓度，向培养液中加入DMSO；GSI组：按10 μmol/L的终浓度，向培养液中加入GSI。24 h后，按照参考文献对三组细胞用微量移液器吸头做间隔5 mm的9×9横竖划伤[7]，以上每组设2个平行皿，实验重复3次。

3.乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性测定：细胞受损后，细胞膜通透性发生改变，LDH从胞内大量释放，因而检测LDH释放量能够定量评价细胞损伤程度[8]。收集培养液，测定步骤按LDH试剂盒说明进行(南京建成生物工程研究所)。在酶标仪上检测340 nm波长处的光密度(optical density, OD)值，并转换为LDH活力。参照LDH试剂盒说明书操作，计算LDH泄漏率。LDH泄漏率=细胞外LDH活性/细胞总的LDH活性×100%。

4.Hochest 33258染色：培养至第7天，吸净培养皿中的培养液，立即用4%多聚甲醛固定30 min，磷酸缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)冲洗3 min×3次后，用hochest 33258染色液染色5 min，去除染色液用抗淬灭封片剂封片。置于荧光显微镜下拍照，以上实验重复三次。

5.Western blot：收集成熟的神经元细胞，PBS漂洗一遍，加入细胞裂解液，1 m裂解液中加10 μl苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的比例充分裂解细胞，4℃，12 000 r/min离心30 min，保留上清，以二辛可宁酸(bicinchonininc acid, BCA)法测定总蛋白浓度。在上清液中加入10×的上样缓冲液，煮沸5 min，-20℃贮存备用。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)采用4%积层胶，10%分离胶，上样量为10 μg。电泳结束后取出凝胶电转移至同等大小的硝酸纤维素膜上。转移后的硝酸纤维素膜置于封闭液(奶粉1 g溶解于20 ml的洗涤缓冲液(tris buffered saline with tween, TBST))1 h，用兔抗激活型caspase-3单克隆抗体(1 ∶500)，兔抗caspase-3单克隆抗体，4℃过夜，次日 TBST漂洗5 min×3次；HRP联山羊抗兔IgG( 1 ∶10 000)，室温处理1 h，TBST漂洗 5 min×3次，HRP显色液中反应至条带清晰。

三、 统计分析

结 果

一、细胞培养与划伤模型

体外培养的大鼠皮层神经元在接种后2 h左右大部分已经贴壁，接种初期细胞呈圆形，周边光晕明显。当培养至5 d时 ,神经元胞质丰富，细胞核圆形居中央，神经元大部分突起长并有许多分叉，突起互相交织成网状，形成神经网络。第6天划伤后即见划伤区域神经元结构完全消失，呈空白区，可见较多细胞碎屑，损伤区周围细胞突起受损(图1)。

二、LDH测定

对细胞划伤后的LDH漏出进行测定以研究GSI对神经元的保护作用，结果显示：GSI预处理组的LDH明显低于划伤组(P<0.05)，而DMSO组与划伤组比较则没有明显区别(P>0.05)(图2)。

三、Hochest 33258染色

使用Hochest 33258染色来检测神经元损伤后的凋亡水平。荧光显微镜下，正常细胞核边缘光滑、完整而且密度均一，核内染色质均匀淡染；凋亡细胞核固缩、核染色质致密伴荧光染色增强，部分细胞内可见细胞核碎裂及凋亡小体形成(图3)。结果显示：GSI预处理组凋亡细胞数明显少于损伤组(P<0.05)，DMSO组与划伤组比较则没有明显区别(P>0.05, 图4)。

四、Caspase-3蛋白表达检测

Western-blotting方法分析caspase-3蛋白表达水平，结果显示(图5)：GSI预处理组活化的caspase-3蛋白明显少于损伤组(P<0.05)，DMSO组与划伤组比较则没有明显区别(P>0.05)。

图1 培养成熟的神经元的形态 (×10)

Fig 1 Morphology of mature neuron (×10)

Black arrow indicated the mechanical injury.

图2 神经元损伤后LDH测定

Fig 2 LDH detection after neuron injury

aP<0.05,vsinjury group and DMSO group.

图3 神经元损伤后的凋亡水平

Fig 3 Apoptosis level of neuron after injury

A: Injury group; B: DMSO group; C: GSI group.

图4 Hochest 33258染色结果

Fig 4 The stain results of Hochest 33258

aP<0.05,vsinjury group and DMSO group.

图5 Caspase-3蛋白表达水平

Fig 5 The expression level of caspase-3

A: The results of Western blot; B: The results of relative ratio.

aP<0.05,vsinjury group and DMSO group

讨 论

Notch信号是调节细胞自我更新、分化的关键信号通路之一。Notch信号的异常活化已被证明与包括脑胶质瘤在内的多种恶性肿瘤的发生进展有关[9]，但其在脑损伤中的研究却相对较少。Notch受体能够被Notch配体家族所激活。目前的研究表明，Notch信号通路的激活需要经过三步酶切过程：首先在细胞内，合成的受体蛋白单链前体分子被高尔基体内的furin蛋白酶酶切，酶切位点在Notch跨膜区胞外端的Sl位点，酶切形成的胞外Notch结构域(extracellular Notch domain, ECN)和Notch跨膜片段(Notch transmembrane fragment, NTM)通过Ca2+依赖的非共价键结合在一起，形成异二聚体形式的成熟Notch受体，并转运至细胞表面。当配体与胞外区结合后，Notch受体在解离素-金属蛋白酶家族的肿瘤坏死因子-α-转换酶(tumor necrosis factor -α- convening enzyme, TACE)的作用下，于S2酶切位点发生第二次酶切，释放部分胞外片段。γ-分泌酶(依赖早老素1)进行组成性酶切过程，发生于S3酶切位点。经过此步酶切过程，形成可溶性NICD并转移至核内。在核内NICD与CSL(CSL是CBF-1, Su(H)和Lag的合称，它们是Notch信号在核内活化的转录因子，即CSL= CBF-1/Su(H)/Lag。CBF-1：C-启动子结合因子1(C-promoter binding factor-1), Su(H)：suppressor of hairles)蛋白结合，将原本“协同抑制复合物”转换为“协同活化复合物”，并进而与DNA形成多蛋白-DNA复合体，激活相关基因的表达[10]。GSI是一种γ-分泌酶抑制剂，它作用于早老素1分子而阻断γ-分泌酶的作用，减少NICD的产生，下游信号分子由于缺少或减弱NICD的启动作用处于静止或下调的状态[3]。

本研究中采用的神经元损伤模型用微量移液器塑料滴头机械性划伤，操作简易，较好模拟了脑损伤后神经元损伤机制，利于观察和研究神经元损伤及其反应[7]。LDH存在于正常细胞的胞质中，细胞膜受损后被释放到胞外。神经系统损伤可见脑脊液中LDH水平升高，与损伤程度呈正相关，所以我们使用LDH水平衡量培养神经细胞损伤程度，而且结果证明GSI预处理确实减少了损伤造成的LDH漏出。

Caspase是细胞凋亡程序中一类关键的同源半胱氨酸蛋白酶。caspase家族作为特异的死亡信号转导分子，在细胞凋亡过程中起重要作用。其中caspase-3是caspase依赖性细胞凋亡途径中的重要执行者，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。Caspase-3作为细胞凋亡的关键性蛋白酶在正常情况下存在于胞质中，损伤等一些刺激因素作用下被激活，水解胞质、胞核蛋白，破坏细胞骨架，导致凋亡细胞解体，切断凋亡细胞与周围细胞的联系，关闭DNA的复制与修复，降解DNA，最后将细胞解体并包裹形成凋亡小体[11,12]。降低了caspase-3的活化和凋亡细胞的数量。本实验中发现GSI预处理明显抑制了caspase-3的活化，同时Hochest 33258染色结果也证明GSI预处理减少了凋亡细胞在总细胞中的比例。

综上所述，GSI可明显减轻神经元损伤后的LDH漏出，抑制损伤所引起的caspase-3的表达并且抑制损伤所造成的细胞凋亡，对神经元机械性损伤起到保护作用。在下一步工作中，我们将对抑制Notch信号通路保护神经元损伤这一现象的具体机制再做深入探讨。

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ProtectionofGSIonmiceneuronwithmechanicalinjury

LIUJian1,ZHANGLei1,WANGKai1,HUIHao1,DAIPeng2,HAILuming2,RAOWei1,FEIZhou1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital;2DepartmentofPharmacogenomics,SchoolofPharmacy,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe role of gamma-secretase inhibitor (GSI) in mechanical-injured cortical neuron in vitro is investigated.MethodsGSI (10 μmol/L) pretreatment applied to cultured cortical neuron at 24 h before mechanical injury. Lactate dehydrogenase (LDH), Hochest staining and expression of caspase-3 were measured after injury.ResultsGSI pretreatment reduced the leakage of LDH and suppressed neuron apoptosis caused by mechanical injury.ConclusionGSI can protect the neuron against mechanical injury.

Neuron; Injury; Apoptosis

1671-2897(2016)15-201-04

·神经损伤研究·

R 651.1

A

刘剑，硕士，E-mail: 534007233@qq.com

*通讯作者： 费舟，教授、主任医师、博士生导师，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2014-08-10；

2015-01-20)