殷玥 李晨 余璐 骆文静 张文斌* 马恒* (第四军医大学: 预防医学系劳动卫生与环境卫生学教研室; 基础医学院病理生理学教研室; 基础医学院病理学教研室, 陕西 西安 700)

有氧间歇训练抑制高脂喂养小鼠海马神经元损伤

殷玥1,2李晨2余璐3骆文静1张文斌1*马恒2*
(第四军医大学:1预防医学系劳动卫生与环境卫生学教研室;2基础医学院病理生理学教研室;3基础医学院病理学教研室, 陕西 西安 710032)

目的肥胖是认知缺陷的独立危险因素，但相关机制仍待阐明。本研究旨在探讨有氧间歇训练(AIT)对高脂(HF)饮食诱导的肥胖小鼠海马神经元损伤的影响和可能的机制。方法40只2个月龄C57小鼠随机分为：正常饮食对照组(Con)；正常饮食间歇训练组(Con+AIT)；高脂饮食组(HF)；高脂饮食间歇训练组(HF+AIT)。部分实验中采用20只2月龄去乙酰化酶3(SIRT3)敲除小鼠(KO)随机分为：高脂敲除组(HF KO)；高脂敲除间歇训练组(HF KO+AIT)。12 w后测定各组小鼠学习记忆能力，海马神经元的氧化应激程度及凋亡。结果与正常饮食对照组相比，12 w HF喂养导致小鼠肥胖，体重显著增加。Morris水迷宫定位航行实验显示，高脂饮食(HF)小鼠逃避潜伏期显著延长；平台搜索实验中，HF小鼠在目标象限的停留时间显著缩短(P<0.05)。HF组海马神经元丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平显著升高，而海马神经元线粒体抗氧化酶：锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和过氧化氢酶(catalase)的活性却显著降低(均P<0.05)。并且，HF组海马神经元中SIRT3表达水平显著减少。与HF组相比，AIT可显著增强HF小鼠海马神经元SIRT 3表达进而增强其下游MnSOD和Catalase活性，减少HF组海马神经元氧化应激，并改善学习记忆能力。但是，在SIRT 3敲除小鼠中，AIT对HF小鼠海马神经元的保护作用在被显著抑制(均P<0.05)。结论AIT可有效上调海马神经元SIRT 3表达，增加线粒体抗氧化酶活性，进而改善HF小鼠认知能力。SIRT 3可能是AIT抑制HF海马神经元损伤的关键因子。

高脂饮食; 有氧间歇运动训练; 海马; 学习记忆能力; 去乙酰化酶3

全球肥胖症患者已逾有12亿。我国的相关人群已接近总人口的1/4。研究发现，肥胖是认知缺陷的独立危险因素，肥胖个体认知功能下降同时伴有相应的海马区神经元损伤[1]。探索肥胖个体认知障碍的发生机制和防治措施具有重要意义。临床研究及动物实验都证实，运动训练可对认知功能产生积极影响[2]。有氧间歇训练(aerobic interval training, AIT)是新兴的运动训练。AIT不仅可有效提高个体运动能力及机体健康状况，还可对心血管疾病以及缓解肥胖产生明显的治疗效果[3]。但是，AIT对高脂饮食小鼠海马组织的影响及作用机制尚不清楚。本研究采用高脂饮食喂养建立肥胖小鼠模型，旨在观察AIT能否通过保护海马神经元改善肥胖个体认知障碍。

材料与方法

一、实验材料

雄性C57BL/6小鼠由第四军医大学实验动物中心提供。Sirt3 基因敲除小鼠购自于美国JAX实验室。抗去乙酰化酶3(sirtuin3, SIRT3)、抗甘油醛3 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体均购自美国Cell Signaling公司。过氧化氢酶(catalase)和锰超氧化物歧化酶(mn superoxide dismutase, MnSOD)试剂盒购自美国Cayman Inc公司。丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde, MDA)检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen species, ROS)荧光探针购自北京碧云天生物技术研究所。TUNEL试剂盒为美国Roche公司产品。

二、实验分组

40只C57BL/6小鼠随机分为4个组：正常饮食对照组(Con+STA)；正常饮食间歇训练组(Con+AIT)；高脂饮食组(HF+STA)；高脂饮食间歇训练组(HF+AIT)。部分实验中采用20只2月龄SIRT3敲除小鼠(KO)随机分为2个组：高脂敲除组(HF KO)；高脂敲除间歇训练组(HF KO+AIT)。

三、高脂喂养及AIT训练方案

正常饮食组参照国家啮标准喂养，高脂饲料参照文献报道配置[4]。连续喂养12 w，有氧间歇训练(AIT)方案 参照文献设定训练方案为[6]实验过程共进行11 w。

四、Morris水迷宫检测

水迷宫检测系统参照文献报道方案进行[5]。记录每天4个象限的平均上台潜伏期，以评判小鼠的空间学习能力。

五、海马神经元内ROS含量的检测

用ROS敏感的荧光探针(CM-H2DCFDA)标记海马神经元，在荧光显微镜下观测细胞内H2DCFDA荧光强度的变化，以荧光强度( fluorescence intensity, FI)反映细胞内ROS含量的变化。荧光光谱仪检测设定为488 nm(激发光)和525 nm(发射光)，ROS阳性细胞在整个核区被染呈红色。拍照后用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0计算平均吸光度(A)值。

六、SIRT3表达的Western blot检测

BCA法蛋白定量，常规WB法，凝胶成像分析

七、Catalase及MnSOD酶活性的测定

Catalase和MnSOD酶活性的测定采用相应的检测试剂盒，严格按说明书进行测定。

八、统计学处理

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析。应用ANOVA检验多个样本均数间差异性检验，若总体差异显著, 再以post hoct检验分析相应两组间显著性差别，以P<0.05 为差异有显著性。

结 果

一、AIT改善高脂饮食小鼠空间学习和记忆能力

定位航行实验中，HF小鼠逃避潜伏期显著延长(图1A)；平台搜索实验中，HF小鼠在目标象限的停留时间显著缩短(P<0.05, 图1B)。与HF组相比，HF KO+AIT组小鼠的逃避潜伏期缩短(图1A)、在目标象限的停留时间延长(图1B)(P<0.05)。该结果提示，AIT则可显著改善HF小鼠的空间学习和记忆能力。

二、AIT显著减轻高脂肥胖小鼠海马神经元脂质过氧化和氧化应激损伤

与正常饮食组相比，HF小鼠海马神经元ROS水平和MDA含量显著增加(P<0.05, 图2)。与HF小鼠相比，HF+AIT小鼠海马神经元ROS水平和MDA含量显著降低(P<0.05, 图2)。上述结果提示AIT可有效减轻高脂肥胖小鼠海马神经元中的脂质过氧化和氧化应激损伤。

三、AIT显著增加高脂肥胖小鼠海马神经元抗氧化酶活性

线粒体抗氧化酶在防御氧化应激损伤中发挥关键作用。与Con组相比，HF小鼠海马神经元Catalase和MnSOD酶的活性显著降低(P<0.05, 图3)。经过AIT后，HF小鼠海马神经元Catalase和MnSOD酶的活性均显著提高(P<0.05, 图3)。

四、AIT上调高脂肥胖小鼠海马神经元SIRT3水平

SIRT3是线粒体抗氧化酶Catalase和MnSOD酶的重要上游调节因子。Con组相比，HF小鼠海马神经元中SIRT3表达水平显著降低(P<0.05, 图4)，而AIT可有效提高HF小鼠海马神经元SIRT3水平(P<0.05, 图4)。

五、AIT通过SIRT3调节高脂肥胖小鼠海马神经元抗氧化酶活性

采用SIRT3基因敲除(KO)小鼠，观察各组海马神经元抗氧化酶活性的影响(图5)。与野生型小鼠相比SIRT3 KO鼠在高脂喂养后，海马神经元的Catalase和MnSOD酶活性降低，ROS水平升高，即氧化应激损伤进一步恶化(P<0.05, 图5B～ D)；并且，经AIT后，并不能改善SIRT3敲除鼠在高脂喂养后的抗氧化酶活性和氧化应激损伤(P>0.05, 图5)，提示SIRT3是AIT上调海马神经元抗氧化酶活性的重要信号机制。

六、AIT通过SIRT3保护高脂肥胖小鼠海马神经元

在野生型小鼠中，AIT可有效减少HF小鼠海马神经元凋亡(P<0.05, 图6)；与野生型小鼠相比，SIRT3 KO鼠在HF喂养后的海马神经元凋亡显著增加(P>0.05, 图6)，并且， AIT抑制HF小鼠海马神经元凋亡的保护作用在SIRT3 KO小鼠中消失。

图1 AIT对高脂喂养的肥胖小鼠学习记忆能力的影响

Fig 1 Effect of AIT on learning and memory ability of mice fed with high fat diet

A: Escape latency of place navigation test; B: Staying time in the quadrant in space probe test.

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group.

图2 AIT对高脂喂养的肥胖小鼠海马神经元脂质过氧化和氧化应激损伤的影响

Fig 2 Effect of AIT on lipid peroxidation and oxidative stress in the hippocampus of mice fed with high fat diet

A: The content of MDA in hippocampal neuron; B: The ROS level in hippocampal neuron.

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group

图3 AIT对高脂肥胖小鼠海马神经元抗氧化酶活性的影响

Fig 3 Effect of AIT on the activity of antioxidant enzymes in the hippocampus of mice fed with high fat diet

A: The activity of catalase in hippocampal neuron; B: The activity of MnSOD in hippocampal neuron.

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group

图4 AIT对高脂喂养的肥胖小鼠海马神经元SIRT3表达的影响

Fig 4 Effect of AIT on SIRT3 expression in the hippocampus of mice fed with high fat diet

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.05,vsHF group.

图5 AIT对SIRT3敲除的肥胖小鼠海马神经元抗氧化酶活性的影响

Fig 5 Effect of AIT on the activity of antioxidant enzymes in the hippocampal neurons of SIRT3 knockout mice with high fat diet

A: Expression of SIRT3 in hippocampal neuron; B: Effect of AIT on the activity of MnSOD in hippocampal neuron; C: Effect of AIT on the activity of catalase in hippocampal neuron; D: Effect of AIT on the level of ROS in hippocampal neuron.

aP<0.05,vsWT HF group;bP<0.05,vsKO HF group.

图6 AIT对SIRT3敲除的肥胖小鼠海马神经元凋亡的影响

Fig 6 Effect of AIT on the apoptosis of hippocampal neurons in SIRT3 knockout mice with high fat diet

aP<0.05,vsWT HF group;bP<0.05,vsKO HF group.

讨 论

由于高脂饮食和缺乏运动锻炼，肥胖已成为一种危害人群健康的慢性代谢性疾病。肥胖与认知功能障碍密切相关，长期高脂饮食的人群存在认知功能障碍、失忆、阿尔兹海默症等问题。海马区是学习和记忆的代表区，与认知功能密切相关，肥胖引起海马区损伤进一步导致个体认知功能下降。神经元对氧自由基损害尤为敏感。肥胖引起海马损伤主要是由于脂肪酸代谢增强，氧自由基产生增多，引起神经元细胞膜过氧化，Park等则发现高脂膳食可明显减少海马神经细胞的新生，并且引起血清和海马区脑组织内的MDA含量升高，提示高脂膳食加剧脑内脂质过氧化反应[6]。临床研究也表明认知功能减退[7]。我们的研究再次证实高脂饮食诱导的肥胖可导致海马神经元氧化应激损伤和凋亡增加，破坏小鼠的认知能力。SIRT3是线粒体内的重要去乙酰化酶，可以通过使MnSOD酶和Catalase去乙酰化，从而增强其抗氧化功能。在糖尿病和肥胖人群中SIRT3的活性水平和MnSOD酶的表达水平均下降[8]。但SIRT3在肥胖引起的认知功能障碍中的作用尚不明确。我们的研究进一步证实：高脂膳食诱导肥胖引起海马神经元损伤氧化应激水平增加，主要是由于去乙酰化酶SIRT3的表达水平下降和抗氧化酶系的功能受损所致。

AIT是一种新的运动训练方式，可提高心肺和肌肉功能，对于糖尿病，肥胖症和阿尔兹海默症等认知障碍也具有治疗作用。运动训练可以提高海马的可塑性，减少神经元的凋亡，并改善学习记忆的能力[7]。动物实验还发现：自主轮跑运动可使小鼠海马齿状回新生神经细胞数量增多，空间记忆能力增强[9]。AIT还增强动物脑内SOD的活性，降低MDA的含量，增强机体的抗氧化能力和清除自由基能力[10]。本研究证实，AIT可有效增高肥胖小鼠海马神经元内SIRT3的表达水平，从而提高线粒体内SOD和Catalase等抗氧化酶活性，减少ROS和MDA的含量，进而改善肥胖小鼠学习记忆能力。通过敲除小鼠，我们更明确地发现线粒体内SIRT3的表达降低是抗氧化酶系统削弱的主要原因，表明SIRT3是保护肥胖小鼠海马神经元的重要调控因子。本研究提出SIRT3是肥胖人群认知障碍的重要干预靶点，有氧间歇训练作为一种普遍的可接受的运动方式，可以成为肥胖治疗与改善认知功能的综合治疗手段。

1Kanoski SE, Davidson TL. Western diet consumption and cognitive impairment: links to hippocampal dysfunction and obesity [J]. Physiol Behav, 2011, 103(1): 59-68.

2Hopkins ME, Davis FC, Vantieghem MR, et al. Differential effects of acute and regular physical exercise on cognition and affect [J]. Neuroscience, 2012, 215: 59-68.

3Brum PC, Bacurau AV, Medeiros A, et al. Aerobic exercise training in heart failure: impact on sympathetic hyperactivity and cardiac and skeletal muscle function [J]. Braz J Med Biol Res, 2011, 44(9): 827-835.

4Hafstad AD, Lund J, Hadler-Olsen E, et al. High- and moderate-intensity training normalizes ventricular function and mechanoenergetics in mice with diet-induced obesity [J]. Diabetes, 2013, 62(7): 2287-2294.

5van Praag H, Kempermann G, Gage FH. Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus [J]. Nat Neurosci, 1999, 2(3): 266-270.

6Park HR, Park M, Choi J, et al. A high-fat diet impairs neurogenesis: involvement of lipid peroxidation and brain-derived neurotrophic factor [J]. Neurosci Lett, 2010, 482(3): 235-239.

7李军, 钮文异, 杨丽华, 等. 肥胖对8～9岁儿童认知能力影响的研究 [J]. 中国预防医学杂志, 2002, 3(4): 332-334.

8Boyle KE, Newsom SA, Janssen RC, et al. Skeletal muscle MnSOD, mitochondrial complex II, and SIRT3 enzyme activities are decreased in maternal obesity during human pregnancy and gestational diabetes mellitus [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2013, 98(10): E1601-E1609.

9Redila VA, Christie BR. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus [J]. Neuroscience, 2006, 137(4): 1299-1307.

10Aksu I, Topcu A, Camsari UM, et al. Effect of acute and chronic exercise on oxidant-antioxidant equilibrium in rat hippocampus, prefrontal cortex and striatum [J]. Neurosci Lett, 2009, 452(3): 281-285.

Aerobicintervaltraininginhibitshippocampalneuroninjuryinmicewithhighfatdiet

YINYue1,2,LIChen2,YULu3,LUOWenjing1,ZHANGWenbin1,MAHeng2

1DepartmentofLaborHygienics;2DepartmentofPathophysiology;3DepartmentofPathology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveObesity is an independent risk in cognitive deficits, but its mechanism remains to be discovered. The protection and mechanism of aerobic interval training (AIT) in hippocampal neuron injury of high fat diet mice are discussed.MethodsForty 2-month-old C57BL/6 mices were randomly divided into control group (Con); Con+AIT group; high fat group (HF) and HF+AIT group. Another twenty 2-month-old Sirtuin3 knock out (SIRT3 KO) mice were randomized into HF KO group and HF KO+AIT group.ResultsCompared with those in control diets, high fat diet for 12 w significantly increased the weight and induced the obesity. The Morris Water-maze training suggested the spatial memory dysfunction in high fat diet group. The level of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) was increased in the HF group, while the activity of Mn superoxide dismutase (MnSOD) and catalase and the expression of SIRT3 were decreased (P<0.05). AIT may enhance the SIRT3 expression of hippocampal neuron in HF group, which improved the activity of MnSOD and catalase and alleviated the oxidative stress and injury of cognition ability. However, the protection was suppressed in SIRT3 knock-out mice (P<0.05).ConclusionAIT improves the expression of SIRT3 and the activity of mitochondria anti-oxidative enzyme, which ameliorates the cognition of high fat diet mice. SIRT3 may be the key factor that AIT suppresses hippocampal neuron injury induced by the high fat diet.

High-fat diet; Aerobic interval training; Aerobic interval training; Studying and memory ability; SIRT3

1671-2897(2016)15-209-04

·神经损伤研究·

R 151.1; R 338

A

国家自然科学基金资助项目(31201037，81170108，81322004，81330045，81102119)

殷玥，硕士研究生，E-mail: music1021@126.com

*通讯作者： 马恒，副教授，E-mai: hengma@fmmu.educ.cn；张文斌，副教授，E-mail: zwb@fmmu.edu.cn

2015-07-31；

2015-09-15)