苏建红，郭成，张军高，漆永红，曹素芳，李敏权,

(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州 730070；3.甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃 兰州 730070)



洋葱贮藏期干腐病致病镰刀菌的鉴定及室内药剂毒力测定

苏建红1,2，郭成2，张军高1，漆永红2，曹素芳3，李敏权1,2

(1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州 730070；3.甘肃省农业科学院林果花卉研究所，甘肃 兰州 730070)

【目的】 明确洋葱贮藏期干腐病致病镰刀菌的病原菌.【方法】 采用形态学与分子生物学方法对洋葱干腐病病原种类进行了鉴定，在CLA培养基上对两株典型菌株的菌落形态和培养特征进行了观察和描述.【结果】 rDNA-ITS序列测定和同源性比对结果表明，两菌株的ITS序列分别与GenBank数据库已知尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)的同源性均达99%，其片段大小分别为519 bp和521 bp.致病性测定结果表明，两种菌均能引起洋葱干腐病，其中尖孢镰刀菌的致病力强于层出镰刀菌.室内药剂毒力测定结果表明，43%戊唑醇对两种镰刀菌的抑菌效果最好.【结论】尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和层出镰刀菌(F.proliferatum)是洋葱贮藏期干腐病的病原菌，由层出镰刀菌引起的洋葱干腐病属首次报道.

洋葱；贮藏期；干腐病；形态和rDNA-ITS鉴定；毒力测定

洋葱(AlliumcepaL.)属百合科(Liliaceae)葱属二年生草本植物，营养丰富，具有多种保健功效.洋葱是欧美国家的主要蔬菜，其栽培面积仅次于马铃薯、番茄.我国洋葱种植面积和产量均居世界首位，目前我国洋葱在华北、东北、华中、西北等各地均有大面积的种植等，这些地区均已经形成产业化种植[1].

干腐病又名枯萎病，是一种常见的真菌病害，苗期、成株期、贮藏期均可发病.田间发病初期下位叶黄化、萎蔫或弯曲，生育盛期洋葱鳞茎侧面呈软腐状腐败，后扩展到茎盘，严重时地上部全部萎蔫，茎盘变褐枯死.湿度大时鳞片间产生白色或灰白色霉状物.干燥条件下，病组织变紫死亡或枯死.洋葱干腐病最早发现于意大利[2]，随后在日本、南非、美国等国发生.洋葱贮藏期干腐病是在洋葱贮运过程中发生的一类病害，其主要症状表现为洋葱干瘪，有时甚至外观表现正常，但内部出现中空，干瘪等症状，使洋葱失去食用价值.镰刀菌是一种广泛存在的致病真菌能引起洋葱的几种病害.据徐冬等[2]报道尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)、茄镰刀菌(FusariumsolaniSacc)和串珠镰刀菌(FusariummoniliformeSheld)可引起嘉峪关洋葱田间干腐病.漆永红等[3]报道，尖孢镰刀菌(F.oxysporumSchlecht)引起洋葱基盘腐烂病，在田间的症状主要是引起洋葱基盘及根系腐烂，从而导致洋葱的枯萎，造成严重损失.

近年来，贮藏期洋葱病害发病严重，损失较大，洋葱贮藏期病害成了一个迫切需要研究和解决的问题[4].关于洋葱贮藏期干腐病及其病原的研究报道较少，刘振华等[5]报道了黑曲霉(Aspergillusniger)引起的洋葱贮藏期黑曲霉病，国内外的学者对大蒜、大葱、蒜薹贮藏期的干腐病、青霉病、灰霉病、污斑病等病害进行了研究[6-10].鉴于此，本试验对甘肃省洋葱主产区贮藏期干腐病进行研究，以确定其病原菌，并通过室内药剂筛选，选出化学防治的最佳药剂，为控制这两种贮藏期的病害奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 病样采集和病原菌分离

2012～2013年在嘉峪关市的新城镇、天水市的甘谷县、秦安县、秦城区、麦积区、兰州市的安宁区、城关区、西固区、七里河区、平凉市的崆峒区、泾川县采集洋葱干腐病病样50个.采用常规组织分离法：取病健交界组织，切成0.5 cm左右小块，用0.1%升汞表面消毒1 min，无菌水冲洗3次后置于PDA平板上25 ℃下培养3 d，待长出菌落后，转皿备用.

1.2 病原菌鉴定

1.2.1 形态鉴定 采用稀释法进行单孢分离[11]，制备孢子悬浮液接入WA培养基，12 h后镜检，当单个孢子萌发芽管时连同培养基切取转入CLA培养基上，置于光照条件下，待菌落长出后转PDA培养基上，备用.

根据形态学和分子生物学特征，对镰刀菌进行种的鉴定，形态学特征参考Burgess等[12]和Booth等[13]的描述进行.

1.2.2 rDNA-ITS序列分析 病原菌的培养及基因组DNA提取，在形态学特征鉴定的基础上，将分离获得的菌株，采用CTAB法提取DNA.将镰刀菌菌饼在PDB(PDA不含琼脂)培养液培养48～72 h，离心后用滤纸过滤回收菌丝体.基因组DNA的提取与纯化根据修改后Paul[14]的方法进行，使用真菌的通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(由上海生工合成).以25 μL体系(10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，上引物1 μL，下引物1 μL，2.5 U/μLTaq酶0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O17 μL)进行PCR扩增[15]，扩增后的产物送上海生工公司测序，将测序结果与GenBank中核酸数据库中的ITS区相关序列进行同源性比较，明确其系统发育地位.

将待测菌株的基因序列与GenBank核苷酸数据库中的基因序列进行同源性比较，下载同源性最高的序列，并用ClustalX(1.8)软件进行多重序列比较后，再用Mega(4.0)软件采用邻接法构建了系统发育树.

1.3 致病性测定

1.3.1 供试菌株及品种 菌株为从采集病样标本中分离鉴定获得的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)菌株F1和层出镰刀菌(F.proliferatum)菌株F2，供试的洋葱品种为‘牧童’，由嘉峪关新城镇农技站提供.

1.3.2 接种方法 将供试菌株在25 ℃条件下培养72 h，将健康洋葱鳞茎用酒精进行表面消毒后，在洋葱的鳞茎部对称等距离取三点切1～2 cm伤口，将纯化的真菌菌饼(直径5 mm)放入伤口内密封，每种菌株接种10个洋葱，接菌后置于25 ℃培养箱，分别于培养7 d后逐日逐个观察，统计发病率和病情指数.以接种灭菌蒸馏水作为空白对照，3次重复.

1.4 室内药剂抑菌作用

1.4.1 供试菌株 尖孢镰刀菌(F.oxysporum)菌株F1和层出镰刀菌(F.proliferatum)菌株F2.

1.4.2 供试药剂 0.5%氨基寡糖素EW(北海国发海洋生物有限公司)、33%苯甲丙环唑WG(浙江世佳科技有限公司)、43%戊唑醇EC(华北制药集团爱诺有限公司)、90%多菌灵SC(上海禾本药业有限公司)、25%丙环唑EC(永农生物科学有限公司)、20%乙蒜素EW(河南省南阳卧龙农药厂)、37%苯醚甲环唑EC(山西绿洲农业科技有限公司)和4%嘧啶核苷类抗菌素EW(成都西部爱地作物科学有限公司).

1.4.3 室内毒力测定 采用平皿菌丝生长抑制法测定[16].将供试杀菌剂分别稀释成系列浓度(液体杀菌剂直接加灭菌水等倍稀释，颗粒剂则先完全溶解再等倍稀释)，再加入到PDA培养基中.将供试菌株打取直径为5 mm的菌饼，接种到相应浓度的含药PDA平板培养基中央恒温培养.每种药剂设5个浓度，重复5次，以加等量无菌水的平板培养基为对照；5 d后用十字交叉法测量菌落直径，并计算不同浓度下各药剂对镰刀菌的抑制率.所得数据用SPSS软件进行方差分析，统计回归方程y=ax+b，EC50值和相关系数r.

2 结果与分析

2.1 洋葱干腐病发病症状

该病害在发病初期鳞茎瓣褪色黄化，由外及里逐渐扩展，严重时整个鳞茎萎缩、干瘪，病部着生白色的菌丝.受害鳞茎内部组织逐渐失水黄花、干缩.典型的干腐病严重发生时洋葱鳞茎外观尚好，但内部失水中空干缩，失去食用价值.

2.2 病原菌的分离

采集到洋葱标样50份，共分离得到233株真菌，本研究除镰刀菌外，其他分离物只做属的鉴定，经培养性状和镜鉴分为8类(表1).

表1 洋葱贮藏期干腐病病原分离频率

2.3 病原菌的形态学特征

尖孢镰刀菌：在25 ℃ PDA上培养4 d菌落直径4.5 cm，7 d为9 cm.PDA基物背面乳白色，菌丝绒毛状.大型分生孢子少，两端渐尖，顶细胞微弯曲呈钩状，大小(35.0～47.5) μm×(3.0～5.0) μm，足细胞较明显，多为2～4分隔 (图1-A)；小型分生孢子多，卵形、椭圆形或肾形，假头生，大小(5.1～12.1) μm×(2.5～4.5) μm，0～1分隔 (图1-B)；产孢细胞短，单瓶梗，大小(3.7～12.5) μm×(2.5～3.7) μm，在菌丝上分散生长，单生或具分枝 (图1-C).厚垣孢子单生，球形，直径6～8 μm.

层出镰刀菌：在25 ℃ PDA培养4 d菌落直径平均为36.7 mm，菌落正面呈粉色或红色，背面红色，基物无色.大型分生孢子镰刀状，稍弯，壁薄无色，两端逐渐变尖，大小(12.1～41.8) μm×(1.5～4.1) μm，足胞较明显，1～5隔，多数3隔 (图2-A)；小型分生孢子串生于产孢细胞，长卵形或椭圆形，无隔或具1隔膜，大小(2.3～9.4) μm×(1.1～3.4) μm (图2-B).小型分生孢子串生，常对生长，复瓶梗，形成“V”型结构 (图2-C).

2.4 菌株F1和F2rDNA-ITS序列测定及同源性比较结果

对菌株进行rDNA-ITS序列测定，结果表明，菌株F1和F2的序列片段大小分别为519 bp和521 bp.经测序后，将两菌株的ITS区域序列与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行Nucleotide Blast比对，结果表明，菌株F1和F2分别与GenBank已报道的JN222394、EF611088的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和GU723438的层出镰刀菌(F.proliferatum)的序列同源性达99%，菌株F1和F2分别为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和层出镰刀菌(F.proliferatum)(图3).

A：大型分生孢子(×400)；B：小型分生孢子(×400 )；C：分生孢子梗(×400 ).图1 F1病原菌的形态特征以及不同类型的孢子Fig.1 Morphological characteristic and different types of spores of pathogen F1

A：大型分生孢子(×400)；B：小型分生孢子(×400 )；C：分生孢子梗(×400 ).图2 F2病原菌的形态特征以及不同类型的孢子Fig.2 Morphological characteristic and different types of spores of pathogen F2

2.5 致病性测定

与对照相比，尖孢镰刀菌和层出镰刀菌均对洋葱有致病性.接种7 d后，接种部位有少量的菌丝溢出，14 d后整个伤口被菌丝覆盖.接种尖孢镰刀菌的鳞茎，伤口部位首先被大量菌丝覆盖，且周围的组织逐渐软化.尖孢镰刀菌在洋葱鳞茎上的生长速度快于层出镰刀菌(图4).

2.6 几种杀菌剂的抑菌作用

8种杀菌剂对尖孢镰刀菌和层出镰刀菌菌丝生长均有一定的抑制作用，随着药剂浓度的增大抑制率增加.43%戊唑醇对尖孢镰刀菌和层出镰刀菌抑制效果最好，EC50分别为0.4、0.7 μg/L，其次为25%丙环唑和33%苯甲丙环唑，而90%多菌灵抑制效果最差(表2，3).

3 讨论

1) 徐冬等[2]报道尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)可引起嘉峪关洋葱田间干腐病.漆永红等[3]报道，引起洋葱基盘腐烂病的病原菌为尖孢镰刀菌.本试验分离出洋葱贮藏期干腐病的病原菌为尖孢镰刀菌.尖孢镰刀菌是一个广谱致病性的植物病原菌，可引起多种植物维管系统病害，其致病性存在一定的专化性，甚至有生理小种的分化[11].在洋葱上既可引起洋葱基盘腐烂病，也可引起田间的干腐病，同时又是贮藏期干腐病的病原菌，其中的相关联系及区别有待于进一步研究.

图3 菌株F1和F2病原菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of F1 and F2 based on the sequences of 16S rDNA

图4 两株镰刀菌F1(尖孢镰刀菌)和F2(层出镰刀菌)对洋葱鳞茎的致病性测定结果(14 d)Fig.4 The result of pathogenicity of two strains F1(F.oxysporum)and F2(F.proliferatum) in onion bulbs after 14 days

药剂质量浓度/(μg·L-1)菌落直径/mm抑制率/%毒力回归方程y=a+bxEC50/(μg·L-1)相关系数r20%乙蒜素(EW)14.35.814.2228.65.420.34574.927.45y=2.6772+1.0311x178.90.9789**1144.139.952282.957.600.5%氨基寡糖素(EW)105.914.01205.225.36404.140.58y=2.8408+1.1437x77.30.9818**803.352.661602.760.874%嘧啶抗菌素(EW)62.56.013.041255.421.262504.338.41y=1.7861+1.1746x544.70.9872**5003.549.0310002.860.1437%苯醚甲环唑(EC)331.33.637.64662.53.244.5413252.361.21y=2.4862+0.8701x774.60.9721**26501.869.8353001.574.7125%丙环唑(EC)4.74.331.759.43.347.6218.82.856.08y=3.9863+0.8921x13.70.9754**37.52.462.43751.675.1333%苯甲丙环唑(WG)74.232.2613.93.543.2827.82.756.45y=3.7145+0.9724x20.90.9747**55.52.461.291101.477.9643%戊唑醇(EC)0.24.530.210.43.250.000.82.659.11y=5.3114+1.0324x0.40.9665**1.51.970.31续表2药剂质量浓度/(μg·L-1)菌落直径/mm抑制率/%毒力回归方程y=a+bxEC50/(μg·L-1)相关系数r31.576.5690%多菌灵(SC)3505.422.867003.550.7114002.859.52y=1.6393+1.1134x1043.30.906828002.465.7156001.775.48

**表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.01水平上差异极显著.

表3 几种杀菌剂对层出镰刀菌(F2菌株)菌丝生长的抑制效果

**表示经Duncan氏新复极差法检验差异极显著(P<0.01).

2) 本试验首次报道层出镰刀菌(Fusariumproliferatum(Matsushina)Nirenberg)是引起洋葱贮藏期干腐病病原菌之一，其小型分生孢子串生，与串珠镰刀菌(FusariummoniliformeSheld)的主要区别是串珠镰刀菌小型分生孢子单瓶梗而层出镰刀菌的小型分生孢子梗是复瓶梗，另外串珠镰刀菌的孢子链比层出镰刀菌的孢子链明显要长.李旭双[18]研究得出，层出镰刀菌可引起大蒜的干腐病.国内外一些学者报道了层出镰刀菌可以引起地黄根腐病和玉米穗腐病[11,19-21].

3) 洋葱贮藏期病原种类较多，危害情况复杂.关于其他真菌病原物引起的洋葱贮藏期病害问题还有待于进一步研究.

[1] 李平，郁网庆，杜卫东.国内外洋葱产业现状与发展动向[J].中国果菜，2005(4)：39-40

[2] 徐冬，李敏权，张彦梅.嘉峪关市新城镇洋葱干腐病病原鉴定及致病性测定[J].甘肃农业大学学报，2010，45(6)：110-113

[3] 漆永红，徐冬，张彦梅，等.嘉峪关市洋葱基盘腐烂病病原鉴定及药剂室内毒力测定[J].草业学报，2013，22(5)：339-344

[4] 苏建红，漆永红，郭成，等.洋葱贮藏期主要病害研究进展[J].江苏农业科学，2014,42(10):141-142

[5] 刘振华.大葱,洋葱的常见病害与防治[J].吉林农业,2003(7)：21

[6] 葛芸英,许志刚.大蒜鳞茎腐烂病的病原鉴定[J].植物保护,2001,27(3):10-12

[7] 王成云．葱头腐烂的原因及防治对策[J].北方园艺，2002(4)：68-69

[8] 解宗军,陈宇飞,李立军.胡萝卜，大蒜贮藏期病害发生原因及防治对策[J].北方园艺,2004(6)：70-71

[9] 薛勇.蒜头贮藏期病害发生及防治[J].农村实用科技信息,2000,12:34

[10] 冯艳梅,周世平.蒜薹和大蒜贮藏期主要病害[J].农业科技通讯，2005(9):56

[11] Leslie J F,Summerell B A,The Fusarium laboratory Manual[M].U S A：Blackwell Publishing,2006

[12] Burgess L W，Summerel B A，Bullock A，el al．Laboratory Manual for Fusarium Research (Third Edition)[M]．Sydney：The University of Sydney Press，1994

[13] Gams W.Fusarium,laboratory guide to the identification of the major species[J].Netherlands Journal of Plant Pathology,1978,84(2):84-84

[14] Paul B.Pythium ornacarpum:a new species with ornamented oogonia isolated from soil in France.FEMS Microbiology Letters，1999

[15] 杨秀梅,王继华,王丽花,等.百合枯萎病病原鉴定与ITS序列分析[J].西南农业学报,2010,23(6):1914-1916

[16] 庄敬华，高增贵，陈捷，等．5种杀菌剂对木霉菌及尖镰孢菌的毒力测定[J]．植物保护，2005，31(3)：84-86

[17] 唐启义，冯明光．实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]．北京：科学出版社，2002

[18] 李旭双.大蒜干腐病病原菌分离鉴定及室内药剂筛选[D].哈尔滨：东北农业大学,2012

[19] 王明道,时延光,郜峰,等.1株引起地黄根腐的镰刀菌的鉴定及生物学特性研究[J].河南农业大学学报,2013，47(2):177-181

[20] 卢维宏,黄思良,陶爱丽,等.玉米穗腐病样品中层出镰刀菌的分离与鉴定[J].植物保护学报,2011,38(3):233-239

[21] 张成霞.昆明市3种草坪草根际镰刀菌的分离鉴定[J].草坪与草坪，2010，30(4)：31-38

(责任编辑 赵晓倩)

Identification and fungicide test in vitro of fusarium pathogens of onion dry rot disease

SU Jian-hong1,2,GUO Cheng2,ZHANG Jun-gao1,QI Yong-hong2,CAO Su-fang3,LI Min-quan1,2

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China； 2.Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070，China；3.Institute of Fruit and Floriculture, Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 In order to identify pathogenic Fusarium of onion dry rot during storage.【Method】 The pathogen species were identified through morphological and molecular biological methods.Two typical colony morphology and cultural characteristics were observed and description in the CLA medium.【Result】 With rDNA-ITS sequence analysis and homology comparison,the results showed that the rDNA-ITS sequence of two pathogenic shared 99% similarity with that ofF.oxysporumandF.proliferatum,and their fragments were 519 bp and 521 bp.Pathogenicity test showed that two pathogenic caused onion dry rot,andF.oxysporumwas stronger thanF.proliferatum.Toxicity testing results showed that 43% of Tebuconazole displayed more strongly inhibitive to the mycelium growth of the two pathogens than fungicides.【Conclusion】F.oxysporumandF.proliferatumwere major pathogens of onion dry rot during storage.F.proliferatumcaused onion dry rot was the first reported.

onion；storage；dry rot；morphological and rDNA-ITS identification；toxicity testing

苏建红(1987-)，男，硕士研究生，主要从事植物病害研究.E-mail:304846831@qq.com

李敏权，男，博士，博导，研究员，主要从事农作物病害研究.E-mail:lmq@gsau.edu.cn

公益性行业(农业)科研专项(201503112)； 甘肃省嘉峪关市科技计划项目(12-51，036-036034)； 甘肃省农业科技创新专项(2014GAAS23).

2015-04-10；

2015-06-11

S 432.1

A

1003-4315(2016)05-0078-07