姬厚伟，张丽，赵新海，王芳，刘剑，杨敬国

贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵阳市小河区开发大道96号，550009

超声萃取-气相色谱-质谱法测定烟用水基胶中的5种异噻唑啉酮杀菌剂

姬厚伟，张丽，赵新海，王芳，刘剑，杨敬国

贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵阳市小河区开发大道96号，550009

建立了超声萃取-气相色谱-质谱联用同时检测烟用水基胶中5种异噻唑啉酮杀菌剂的分析方法。烟用水基胶样品经二氯甲烷超声萃取30 min，静置取上清液并加入N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后进行GC-MS选择离子分析，内标法定量。结果表明：5种异噻唑啉酮待测化合物在0.40～16.00 μg/mL范围内线性关系良好，R2为0.9973～0.9997；检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.004～0.15 μg/mL和0.018～0.050 μg/mL，回收率为90.2%～99.1%，相对标准偏差RSD为1.7% ～ 5.7%。该方法具有简单、准确、灵敏等特点，应用于实际样品检测取得了良好效果。

超声萃取；气相色谱-质谱；异噻唑啉酮；烟用水基胶

烟用水基胶是卷烟生产中必需的材料之一，如接装胶、搭口胶，包装胶等。由于该材料水溶性较强，在生产和存放过程中极易因细菌而腐变，因此在其生产和加工过程中通常会添加杀菌防腐剂来控制微生物的生长繁殖或杀死细菌，以防有机质的腐败。异噻唑啉酮类 ( Isothiazolinones)杀菌防腐剂因其具有较好的性价比而得到广泛的应用[1]。研究发现，暴露在环境中的异噻唑啉酮类化合物会存在健康隐患，如甲基异噻唑啉酮具有一定的细胞毒性和神经毒性，与皮肤接触会产生过敏反应等[2-3]。因此，为了提高卷烟产品的吸食安全性，对烟用水基胶中异噻唑啉酮类化合物的检测尤为必要。

目前对异噻唑啉酮类化合物检测方法主要有液相色谱法[4-6]、液相色谱-串联质谱法[7-10]、气相色谱-质谱法[11-13]等，被用于化妆品、环境水样、儿童玩具、纸制食品包装材料等领域。烟用水基胶中异噻唑啉酮类化合物的分析研究报道较少，近年来高效液相色谱方法被发展应用[14-15]，而气相色谱-质谱法尚未见报道。本文采用气相色谱-质谱联仪，对烟用水基胶中的工业上常用的5种异噻唑啉酮类杀菌剂进行了分析研究（见表1），旨在建立烟用水基胶中的异噻唑啉酮类化合物快速、准确的检测方法，为卷烟产品质量安全提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

烟用水基胶（选自卷烟企业）；二氯甲烷（色谱纯，天津市登科化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市登科化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯，天津市登科化学试剂有限公司）；甲基叔丁基醚（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；丙酮（色谱纯，天津市登科化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（色谱纯，天津市登科化学试剂有限公司）；1,2-苯并异噻唑基-3（2H）-酮（BIT）（99%，美国Sigma公司）；2-甲基-3（2H）-异噻唑啉酮（MI）（99%，美国Sigma公司）；5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮（CMI）（99%，美国Sigma公司）；5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮（CMI-d3）（99%，美国Sigma公司）；2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OI）（99%，美国Sigma公司）；4,5-二氯-2-正辛基-3-异噻唑啉酮（DCOI）（99%，美国Sigma公司）；N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（BSTFA）（99%，美国Sigma公司）。

表1 5种异噻唑啉酮类化合物和5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮-d3的结构式、CAS号和分子量Tab.1 Structural formula, CAS numbers and formula weight of five isothiazolinones and CMI-d3

Perkin Elmer Clarus 600型气相色谱-质谱联用仪（美国PE公司）；数控超声清洗器KQ-500DE（昆山市超声仪器有限公司）；分析天平AG104（感量：0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 标准溶液配制

准确称取0.005 g内标5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(CMI)-d3，精确至0.0001 g，置于25 mL的容量瓶中，加入二氯甲烷定容，得到内标标准贮备溶液。

分别称取2-甲基-3（2H）-异噻唑啉酮(MI)、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(CMI)、1,2-苯并异噻唑基-3（2H）-酮（BIT）、2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OI）、4,5-二氯-2-正辛基-3-异噻唑啉酮（DCOI）5种不同质量的异噻唑啉酮标样见表2，精确至0.0001 g，置于50 mL容量瓶中，加入二氯甲烷定容，摇匀，得到混合异噻唑啉酮准贮备液。准确移取5、10、20、50、100、200 μL 混合异噻唑啉酮标准贮备液于6只25 mL容量瓶中，分别加入200 μL内标溶液，用二氯甲烷定容，摇匀，得到一系列不同浓度梯度的异噻唑啉酮混合标准溶液。取不同浓度的标准溶液各1 mL，添加30 μL BSTFA衍生化试剂，在60℃水浴中衍生30 min，冷却至室温，然后用气相色谱-质谱（GC-MS）进行分析。

表2 5种异噻唑啉酮类化合物的称取重量及混合标准贮备液浓度Tab.2 Weight of five isothiazolinones and concentration of mixed standard solutions

1.3 样品前处理

准确称取样品0.2 g于50 mL具塞三角瓶中，添加萃取溶剂二氯甲烷10 mL和内标溶液80 μL，超声30 min，静置取上清液于15 mL离心管，3000 r/min离心5 min，取1 mL过0.45 μm有机相滤膜于色谱瓶，添加30 μL BSTFA衍生化试剂，在60℃水浴中衍生30 min，冷却至室温，然后用气相色谱-质谱（GC-MS）进行定量分析。

1.4 GC-MS分析条件

色谱条件：DB-624（30 m×0.25 mm, 1.4 μm）柱；进样口温度：250℃；载气：高纯氦气，纯度≥99.999%；进样量：2 μL；流速：1.2 mL/min（恒流模式）；分流比：5:1；升温程序：80 ℃保持2 min，10 ℃/min升至220 ℃，然后以20 ℃/min升至240 ℃，保持15 min；传输线温度：240℃；离子源温度230℃；溶剂延迟：6 min；电离方式：EI源；电离能量：70 eV；扫描方式：选择离子监测(SIM)。

采用比较保留时间、标样加入法定性，SIM模式下内标法定量。5种异噻唑啉酮类化合物和内标的保留时间和特征离子见表3。

表3 5种异噻唑啉酮类化合物和5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮-d3保留时间和定性定量离子Tab.3 Retention time, qualitative ions and quantitative ions of the five isothiazolinones and CMI-d3

2 结果与讨论

2.1 1,2-苯并异噻唑基-3（2H）-酮（BIT）的衍生化处理

BIT与其它4种待测化合物分子结构不同，其分子中存在活泼氢，导致高浓度的BIT标准溶液也不能被GC-MS法检测，而其他4种待测化合物的色谱信号较好（图1A）。为了改善BIT的色谱行为，本实验对其进行了衍生化处理（见图1B）。据文献报道，使用重氮甲烷可将BIT上的活泼氢甲酯化，但5种异噻唑啉酮同时衍生时对DCOI的影响较大，致使低浓度的DCOI不能被检出。而本实验选择BSTFA作为衍生化试剂，该方法不仅可以使BIT中的活泼氢硅烷化（见图2），且对其他4种待测化合物无影响。本实验分别对衍生化时间10、20、30、40、50 min和衍生化试剂的用量10、20、30、40、50、60 μL做了单因素优化。实验结果表明，添加30 μL BSTFA不变，硅烷化30 min后测定结果趋于稳定；衍生30 min时间不变，加30 μL BSTFA衍生后的测定结果趋于稳定，因此本实验选加30 μL BSTFA试剂、衍生30 min。

图1 衍生前（A）和衍生后（B）内标和5种异噻唑啉酮的TIC图Fig. 1 Total ion chromatograms of five isothiazolinones and internal standards before(A) and after(B) derivation

图2 硅烷化反应Fig. 2 Silylation reaction

2.2 色谱柱的选择

本实验考察了非极性的HP-5MS（30 m×0.25 mm, 0.25 μm）、中等极性的DB-624（30 m×0.25 mm,1.4 μm）和强极性的HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm,0.25 μm）3种不同极性的色谱柱对5种异噻唑啉酮类化合物分离的效果。实验发现非极性的HP-5MS色谱柱对各种异噻唑啉酮类化合物分离度较好，但MI和CMI拖尾较为明显，从而影响准确定量；而强极性的HP-INNOWAX色谱柱对沸点相对较低的MI和CMI可以得到较尖锐峰形，而沸点相对较高的BIT、OI、DCOI信号响应值较差，主要受极性柱的柱温限制；而中等极性的DB-624色谱柱可实现5种异噻唑啉酮类化合物的完全分离，而且峰形尖锐。因此本实验选择中等极性的DB-624色谱柱（见图1和图3）。

图3 标准样品SIM(C)和样品SIM(D)的总离子色谱图Fig. 3 Total ion chromatograms of standard sample SIM(C) and sample SIM(D)

2.3 萃取溶剂的选择

实验考察了甲醇、正己烷、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯5种萃取溶剂对5种待测物的萃取效果，测定结果见图4。由于OI和DCOI在实际样品并未测出，优化时采用了添加标样的方式。由图4可知，正己烷萃取效率最低，甲醇和二氯甲烷优于甲基叔丁基醚和乙酸乙酯，二氯甲烷和甲醇萃取效果相差不大。但本实验需要用BSTFA对BIT中的活泼氢进行衍生化处理，而甲醇中含有活泼氢，衍生前需将甲醇用氮气吹干，在氮吹过程中会导致MI和CMI一定量的损失，而二氯甲烷可直接衍生，且对其他待测化合物无影响。因此本实验选择二氯甲烷作为萃取溶剂。

图4 不同萃取溶剂对待测化合物萃取效果的影响Fig. 4 Effect of different extraction solvents on extraction efficiency of five isothiazolinones

2.4 萃取时间的选择

本实验考察了超声时间分别为5、10、15、20、30、45 min时的萃取效果，测定结果见图5。由于OI和DCOI在实际样品并未测出，优化时采用了添加标样的方式。由图可知，随着超声时间的增加，测定结果逐渐增大，到30 min时MI和CMI浓度达到最大，30 min后略有减少；而OI、DCOI和BIT的测定结果在30 min后增加趋缓，因此本实验选择超声时间为30 min。

2.5 工作曲线、相关系数、检测限和定量限

分别对6个不同浓度的标准溶液进行GC/MS选择离子模式分析，以待测物与内标物的峰面积比（Y）对相应的待测物浓度（X，μg/mL）进行线性回归分析，得到各待测物的工作曲线回归方程和相关系数（见表4）。 5种异噻唑啉酮类化合物的线性关系良好，R2为0.9973～0.9997。通过稀释最低浓度标准样品，待测组分在仪器上产生不低于3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)所对应的分析物浓度分别计为方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，5种异噻唑啉酮类化合物的LOD 为0.004～0.15 μg/mL，LOQ 为0.018～0.050 μg/mL。可见在本文优化的最佳条件下，5种异噻唑啉酮类化合物均有较好的线性关系及较高的灵敏度。

图5 超声时间对待测化合物萃取效果的影响Fig. 5 Effect of ultrasonic time on extraction efficiency of five isothiazolinones

表4 5种异噻唑啉酮类化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检测限和定量限Tab. 4 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, LODs and LOQs of five isothiazolinones

2.6 回收率和重复性

采用标准加入法测定该方法的回收率，称取一定量的已检测出5种异噻唑啉酮含量的烟用水基胶样品，分3份，分别按照低、中、高3个添加水平加入5种异噻唑啉酮混合标准样品，每个添加水平重复测定6次，结果见表5。由表5可知，5种异噻唑啉酮的回收率为90.2%～99.1%，RSD为1.7% ～ 5.7%，表明本方法的准确性和精密度较好。

表5 烟用水基胶中5种异噻唑啉酮类化合物的回收率和精密度(n=6)Tab. 5 Recoveries and RSDs of five isothiazolinones in waterbased adhesives for cigarettes (n=6)

2.7 实际样品的测定

利用本方法对8种不同类型烟用水基胶中5种异噻唑啉酮类化合物的含量进行了测定，结果见表6。结果表明，MI和CMI是烟用水基胶中应用较多的杀菌剂，BIT应用相对较少，而OI和DCOI在实际样品中均未检出。

表6 烟用水基胶中5种异噻唑啉酮类化合物的含量Tab. 6 Testing results of five isothiazolinones in water-based adhesives for cigarettes μg/g

3 结论

通过对样品提取、衍生化方法以及色谱、质谱测定等条件的优化，建立了一种超声溶剂萃取–气相色谱/质谱联用同位素内标法测定烟用水基胶中5种异噻唑啉酮类化合物含量的方法。该方法简便、准确且重复性好、灵敏度高，可适用于水基胶中5种异噻唑啉酮类化合物的测定。

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Determination of five isothiazolinones in water-based cigarette adhesive by ultrasonic extraction-gas chromatograph-mass spectrometry

JI Houwei, ZHANG Li, ZHAO Xinhai, WANG Fang, LIU Jian, YANG Jingguo
Technology Center, China Tobacco Guizhou Industrial Co. Ltd, Guiyang 550009, China

A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method was successfully developed and validated for simultaneous determination of five isothiazolinones (MI, CMI, BIT, OI, and DCOI) in water-based cigarette adhesive. The water-based adhesive was extracted by ultrasonic extraction with dichloromethane for 30 minutes and the extracts were further derived by N,O-bis (trimethylsily)trifluoroacetamide (BSTFA), and analyzed by gas chromatograph-mass spectrometry in selected ion monitoring mode. Content of each analyte was calibrated by internal standard method. Results showed that the calibration curves of five isothiazolinones were linear in the range of 0.40～16.00 μg/mL with correlation coefficients of 0.9973～0.9997. The limit of detection and limit of quantification for five isothiazolinones were 0.004～0.15 μg/mL and 0.018～0.050 μg/mL, respectively. Recoveries were in the range of 90.1% to 99.1% and the relative standard deviations (RSDs) were 1.7% to 5.7%. The developed method is simple, sensitive and suitable for the analysis of five isothiazolinones in water-based adhesives for cigarettes.

ultrasonic extraction; gas chromatograph-mass spectrometry; isothiazolinones; water-based adhesive

姬厚伟，张丽，赵新海,等. 超声萃取-气相色谱-质谱法测定烟用水基胶中的5种异噻唑啉酮杀菌剂[J]. 中国烟草学报，2016,22（3）

贵州中烟工业有限责任公司科技项目“卷烟包装材料中3种异噻唑啉酮分析研究”（201316）

姬厚伟（1978—），硕士，工程师，主要从事烟用材料及烟草化学分析研究，Tel：0851-83981473，Email: jihouwei@163.com

刘 剑，博士，高级工程师，主要从事烟草及烟气化学分析，Tel：0851-83981463，Email：liuj1208@163.com

2015-06-17

:JI Houwei, ZHANG Li, ZHAO Xinhai, et al. Determination of five isothiazolinones in water-based cigarette adhesive by ultrasonic extraction-gas chromatograph-mass spectrometry [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(3)