邓冬梅，何勍，孙宇飞，梁秀芬，万美玲，吴桂珍，韦烽，陈业祖

（1.广西科技大学生物与化学工程学院,广西柳州545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室（广西科技大学），广西柳州545006）

焦化废水中苯酚降解菌筛选及其降解特性

邓冬梅1，2，何勍1，2，孙宇飞1，2，梁秀芬1，2，万美玲1，2，吴桂珍1，2，韦烽1，2，陈业祖1，2

（1.广西科技大学生物与化学工程学院,广西柳州545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室（广西科技大学），广西柳州545006）

苯酚是焦化废水中含量最多的难降解有毒有机物，筛选高效苯酚降解菌可为通过生物强化提高焦化废水中苯酚的生物降解效率提供合适菌源.本研究以苯酚作为唯一碳源，通过富集驯化方法从柳钢焦化废水缺氧／好氧（A／O）生物处理系统的好氧池活性污泥中筛选分离出一株苯酚降解菌B2.根据16S rDNA序列分析，B2菌株和Staphylococcussciuri的16S rDNA序列相似性达100％，初步表明B2菌株为S．sciuri.进一步通过单因素法考察pH、温度和初始苯酚浓度对B2降解苯酚的影响，并通过响应面法确定B2降解苯酚的最优环境条件.结果表明：pH和浓度的交叉组合对B2菌株的苯酚降解能力影响最大，B2菌株在pH＝7．5，温度为30℃，初始苯酚浓度为2．0 g／L对苯酚的降解能力最高，降解率达到85％.

焦化废水；苯酚；降解菌；筛选；降解特性

0　引言

焦化废水是由煤气净化、原煤高温干馏和化工产品精制过程中产生的废水，成分复杂且难降解，是最难处理的工业废水之一［1－2］.苯酚是焦化废水中最主要的难降解有机物，占焦化废水有机物的60％以上［3］，而且苯酚毒性大会抑制其中氨氮、COD的降解，所以苯酚的降解对焦化废水的达标排放尤其重要.

生物处理是目前焦化废水的主要处理方式，也是苯酚降解的主要途径［4］.生物强化，是为了提高废水生物处理系统的处理能力，而向该系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因重组技术产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质的方法［5］，在提高焦化废水中苯酚降解效率方面有很大应用前景.为将生物强化应用于焦化废水中苯酚降解，苯酚降解菌的筛选十分关键.目前，国内外已筛选获得大量的苯酚降解菌，其中假单细胞菌属微生物最多（Pseudomoma sp．）［6］,其他微生物如洋葱伯克霍尔德菌（BurkholderiacepaciaPW3）［7］，A cinetobacter calcoacetic［8］，Gulosibacter sp．YZ4［9］，丝孢酵母菌属（Trichosporon sp．）［10］，粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）［11］等微生物菌株也均可以降解苯酚.

为达到稳定高效的去除效果，筛选来自工作环境中降解菌及菌株间的复配已成为共识，为此需要更多苯酚降解菌提供复配菌源；环境因素也是实际处理工程中影响去除效果的主要因素.因此本研究希望通过筛选苯酚降解菌，考察环境因素对菌株降解苯酚特性的影响，为生物强化提高焦化废水中苯酚降解效率提供菌源.

1　材料与方法

1．1实验材料

1．1．1菌株

菌株筛选自柳钢焦化废水A／O生物处理系统O池中活性污泥.

1.1.2培养基

富集培养基：每升培养基含蛋白胨0.5 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.05 g，苯酚（根据需要加入），pH 7.2～pH 7.4，细菌富集驯化使用.

分离培养基：每升培养基含K2HPO40.2 g，MgSO40.05 g，（NH4）2SO41.0 g，苯酚1.0 g，pH值在7.2～7.4之间，细菌分离使用［12］.

固体培养基为在液体培养基中投加15 g／L琼脂.

1．2实验方法

1.2.1菌种的驯化和分离

取10mL新鲜活性污泥至装有90mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，手摇振荡20min，将细胞分散.取5mL菌悬液于苯酚浓度为0 g／L的富集培养基中培养24 h.按同样方法，每次取5mL连续转接7次，苯酚浓度依次为0.5 g／L，0.7 g／L，0.8 g／L，1.0 g／L，1.2g／L，1.5 g／L和1.8 g／L，以对苯酚降解菌进行富集和驯化.驯化后菌液经在LB培养基上涂布稀释分离及平板划线纯化后得到纯菌株.将分离得到的纯菌株接种于含有1.0 g／L苯酚的液体分离培养基中进行摇床培养24 h，计算菌株对苯酚的降解率，得到一株可以在分离培养基中生长的苯酚降解菌株，编号为B2.将B2菌株保存在15％的甘油中，存于-60℃冰箱中待用.

1.2.216SrDNA鉴定

利用细菌鉴定通用引物27F和1 492R［13］对菌液进行PCR扩增，引物由上海生工有限公司合成，反应体系和PCR程序如表1和表2所示，4℃保存PCR产物.1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，割胶纯化PCR产物.将纯化后的DNA送往上海立菲生物技术有限公司广州分公司进行序列测定；将序列在NCBI网页上进行BLAST同源性比对.

表1　菌液PCR反应体系Tab.1 The am plification system of bacteria PCR μL

表2　菌液PCR反应程序Tab.2 T he problem of bacteria PCR

1.2.3菌株降解条件及降解特性研究

利用液体分离培养基对B2菌株摇床培养，以苯酚降解率为指标，利用单因素实验研究pH、温度和初始苯酚浓度对菌株生长及降解苯酚的影响.

表3　响应面分析因素与水平Tab.3 Factors and levels of response surface analysis

根据环境单因素实验结果，用Design-Expert软件生成3水平3因素组合条件（如表3所示），根据所生成的各组合条件，利用液体分离培养基摇床培养B2菌株，测定培养2 d后苯酚浓度，计算降解率，所得结果输入Design-Expert软件，生成分析.将B2菌在响应面法所确定的最优条件下进行摇床培养，每隔2 h测定苯酚浓度和菌液浓度，绘制生长曲线和苯酚降解曲线.

1.2.4分析方法

菌种浓度的测定采用比浊法，使用分光光度计于波长600 nm处测定其OD值［14］.苯酚含量采用4-氨基安替比林分光光度法［15］，使用分光光度计于波长510 nm处测定其OD值.

2　结果与讨论

2．1苯酚降解菌筛选与鉴定

富集驯化培养时，在0.28 g／L～1.8 g／L的苯酚环境下，培养液均变混浊，培养后测定培养液里的苯酚浓度也有不同下降，初步说明摇瓶中的菌也具有苯酚降解特性.经平板划线分离，得到一株苯酚降解菌，命名为B2菌株，B2菌株在不含碳源的分离培养基中摇床培养48 h后，菌液变混浊，苯酚降解率达86％，说明B2菌株可以以苯酚为唯一碳源进行生长.B2的16S rRNA序列与数据库Genbank中的Staphylococcus sciuri序列相似性达100％，初步鉴定B2菌株为Staphylococcus sciuri.研究表明Staphylococcus sciuri是一种致病菌，常致尿路感染，对青霉素及头孢类药物有耐药作用，属于Staphylococcus属，是最常见的化脓性菌球，是医院交叉感染的重要来源［16］.Mrozik［17］等发现Staphylococcus sciuri具备苯酚降解能力，但环境条件对其降解能力的影响探讨较少.

2．2 B2菌株降解苯酚单因素实验

2.2.1pH对菌株苯酚降解率的影响

如图1所示，在30℃，初始苯酚浓度为2 000mg／L条件下，pH值在6.5～8.0间，B2对苯酚的降解率均保持在80％以上，其中pH值7.5时，B2对苯酚的降解率最高.此外，在苯酚降解过程中培养液呈酸性（见图2），这可能是因为B2菌在降解苯酚过程中，需要将苯酚开环成为有机酸才能被利用.

图1　不同pH下B2菌株的苯酚降解率Fig．1 Degradation ratios of phenol of B2 at different pH

图2　降酚过程中B2菌液的pH变化Fig．2 Variation of pH in culture when phenol degraded by B2

图3　不同初始苯酚浓度下B2菌株的苯酚降解率Fig．3 Phenol degradation rate of B2 at different phenol concentrations

2.2.2初始苯酚浓度对菌株苯酚降解率的影响

由图3可知，在30℃，pH值在7.5条件下，苯酚初始浓度由500mg／L增加到2 000mg／L，B2菌株对苯酚的降解率逐渐增大，苯酚浓度增加至2 500mg／L，B2菌株对苯酚的降解率略有下降.其中，苯酚浓度在2 000mg／L左右时，B2菌株在48 h内对苯酚降解率最高，达84.1％.

2.2.3温度对菌株苯酚降解率的影响

由图4可知，在初始苯酚浓度2 000mg／L，pH值在7.5条件下，在20℃～30℃之间，B2菌株的苯酚降解率随温度的增加而增加，大于30℃时，降解率随温度的增加而降低，其中在温度30℃，起始苯酚浓度为1 000mg／L时，B2菌株的苯酚降解率最高达89％.

2．2．4响应面法优化菌株苯酚降解条件

17组试验的苯酚降解率结果列于表4中，可以看出：在设计的试验条件下，苯酚最大降解率达到82％，最小降解率为33％，表明不同的温度、pH和初始苯酚浓度下，苯酚降解率有着很大差别.将表4中的结果导入Design－Expert软件，固定一个环境因素的情况下，以另外2个环境因素为X和Y轴，以降解率为Z轴作图，得到在不同降解条件下的苯酚降解率响应曲面.如图5所示，只有pH和浓度的关系凸面较为突出，说明pH和浓度的交叉组合对降解率较为显著，而其余2个相互因素组合对降解率的影响不太明显.由图5还可知，B2菌株降解苯酚的最优条件为：温度30℃，pH值7．5，底物质量浓度2．5 g／L.

图4　不同温度下B2菌株的苯酚降解率Fig．4 Phenol degradation rate of B2 at different temperature

表4　组合条件及对应苯酚降解率Tab.4 Phenol degradation rate of B2 and corresponding environmental conditions

2．2．5菌种生长曲线及降解特性

如图6所示，B2的生长与苯酚的降解几乎是同步的.菌株处于对数生长期时，细胞浓度快速增长，底物降解较快.在12 h左右开始进入对数期，到26 h开始进入稳定期.降解62 h后，苯酚浓度从2 000mg／L降解到340mg／L，降解率达85％.而苯酚降解菌Rhodococcussp．在苯酚浓度为1 160mg／L时，生长受到抑制，24 h才达到生长对数期［18］.已报道的耐高浓度苯酚的苯酚降解菌Gulosibacter sp．YZ4［9］，初始苯酚浓度为2 000mg／L时，降解48 h后，仅有不到30％的苯酚得到降解，但所有的苯酚在76 h内全部降解，和B2菌株的降解特性有很大差异.结果说明B2具有耐受高浓度苯酚的能力和高效苯酚降解能力，在生物强化处理焦化废水等高浓度苯酚废水处理中有一定应用前景，为此，需进一步优化生物强化条件和考察其对实际废水的处理效果.此外，B2菌株的特殊降解特性说明B2菌株的降解机理也有进一步研究价值.

图5　苯酚降解对环境因素的响应图Fig.5 Phenol degradation for responsesurface optimization versus different environmental factors

图6　菌株B2生长过程与苯酚降解过程的关系Fig.6 Growth curve and phenol degradation of strain B2

3　结论

1）经过以苯酚为唯一碳源，从柳钢焦化废水中筛选出了一株具有降解苯酚能力的菌株B2，经16S rDNA测序鉴定为Staphylococcus sciuri；

2）通过环境单因素对B2降解效率的影响以及响应面法优化条件研究，确定B2降解苯酚的最优条件为：温度30℃，pH值为7．5，苯酚初始浓度2．0 g／L，该条件下摇床培养62 h后，苯酚降解率达85％.

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（学科编辑：黎娅）

Screening and characterization of phenol degrading bacteria from the coking wastewater

DENG Dong-mei1,2,HE Qing1,2,SUN Yu-fei1,2,LIANG Xiu-fen1,2, WAN Mei-ling1,2,WU Gui-zhen1,2,WEI Feng1,2,CHEN Ye-zu1,2
(1.School of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006,China;2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources（Guangxi University of Science and Technology），Liuzhou 545006,China)

Phenol was the highest content of toxic and biorefractory organics in coking wastewater.Screening of high efficient phenol-degrading bacteria could provide suitable bacteria for the treatment of coking wastewater by bioaugmenting.In this study,a phenol degrading strain B2 which took phenol as only carbon source was separated and screened by enrichment culture from activated sludge of coking effluent A/O biological treatment system of Liuzhou Iron and Steel.By colony morphology,gram stain,normal physiological and biochemical reactions and 16S rDN A sequencing,the strain B2 was identified as Staphylococcus sciuri.Single factor experiment was then used to investigate the influence of environmental conditions such as pH,temperature and the initial concentration of phenol on phenol degradation ability of B2.Response surface analysis was used further to optimize these environmental conditions.The results showed that cross-over of pH and phenol concentration had the most important effect on the degradation of phenol of B2 and the best condition for phenol-degrading ability of B2was30℃,pH 7.5 and 2.5 g/L for initial concentration of phenol.In the optimum conditions,the degradation rate of phenol was85％when the culture time was62 h.

coking effluent;phenol;degrading strain;screen;degradation

X172；Q939.97

A

2095-7335（2016）04-0093-06

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.04.017

2016－07－15

广西自然科学基金（2014GXNSFBA118249）；2016年广西国家级大学生创新创业训练计划（201610594042）；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划资助（桂教人（2014）7号）；广西高等科学技术研究项目（YB2014201）资助.

邓冬梅，博士，副教授，研究方向：水污染处理，E-mail：deng-dongmei@163.com.