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基于间接竞争原理的流式微球技术快速检测麦芽中赭曲霉毒素A

2016-11-19肖昌彬刘秋桃豆小文杨美华孔维军万丽

分析化学 2016年4期
关键词:快速检测麦芽

肖昌彬 刘秋桃 豆小文 杨美华 孔维军 万丽

摘 要 建立了一种快速、灵敏检测中药麦芽中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)含量的间接竞争流式微球方法。麦芽样品经60%甲醇/PBS提取,加入20%甲醇/PBS溶液稀释5倍后,离心取上清液制备样品。在编码荧光微球上偶联牛血清白蛋白OTA(BSAOTA)复合物,与样品中OTA竞争结合抗OTA特异性抗体,然后加入FITCIgG孵育,离心洗涤后,用流式细胞仪检测微球表面的平均荧光强度,实现样品中OTA的准确定性定量测定。本方法检测OTA的半数抑制浓度IC50为1.20 ng/mL,相关系数R2=0.9892,检出限(IC10)为0.12 ng/mL, 加样回收率为93.9%~97.4%,RSD<3.6%。16份实际麦芽样品中检测到2个阳性样品,OTA的最高含量为3.83

SymbolmA@ g/kg,未超出欧盟的OTA限量标准,与液相色谱串联质谱(LCMS/MS)法检测结果相一致。本方法简单、快速、灵敏、可靠,可拓展用于其它复杂基质中多种真菌毒素的定性与定量检测。

关键词 流式微球技术;间接竞争;麦芽;赭曲霉毒素A;快速检测

1 引 言

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)是由曲霉属和青霉属真菌产生的有毒次生代谢产物[1],具有严重的致癌、致畸、致突变及肝细胞毒性、免疫抑制和生殖紊乱等毒性作用[2],已被国际癌症研究机构[3]列为人类可能的致癌物(2B级),也被美国国家毒理学计划[4]定为极有可能对人类产生致癌性的物质。OTA是食品、农产品及农作物、药用植物中主要的外源性有害污染物,不仅会影响相关产品的质量,而且对人类健康和生命安全存在潜在的威胁[5,6]。世界各国已对其制定了严格的限量标准,如欧盟联合委员会规定谷物中OTA的限量为5.0 μg/kg,谷物制品及其相关产品中OTA的限量为3.0 μg/kg,酒和葡萄汁饮料中OTA的限量为2.0 μg/L[ 7]。因此,开发简单、快速、准确、灵敏且特异性的检测方法,对于保证食品、农产品及药用植物的安全使用以及保证人类健康至关重要[8]。

OTA的检测大多采用仪器分析技术[9~11],如液相色谱荧光法(HPLCFLD)及串联质谱法(LCMS/MS)等。虽然这些分析方法具有灵敏、准确的特点,但需大型的昂贵的仪器,操作步骤繁琐、耗时;此外,食品、农产品、中药材等基质成分复杂,需要严格的前处理和净化步骤,给实际操作带来诸多困难。酶联免疫吸附技术(ELISA)以其高特异性、高选择性、对样品纯度要求不高及样品处理量大的优点,而被用于复杂基质中OTA的快速筛查检测[12,13],但存在灵敏度低、重复性差等不足[14]。

流式微球技术(Cytometric bead array, CBA)[15~20]以一系列荧光强度不同的编码微球为载体,通过激光束激发荧光编码微球,利用流式细胞仪分析微球本身和表面荧光强度完成数据收集和分析,可实现复杂基质中目标物灵敏、准确的快速检测,且重复性和稳定性好、分析时间短、假阳率低。该技术已被应用到多种基质中大分子及小分子化合物的高通量检测[21~25]。OTA为小分子化合物,具有半抗原性、分子量小、单一抗原表位、本身不具免疫原性等特点[26],多采用基于“抗体抗原”特异性识别的竞争型流式微球免疫分析技术,而间接竞争模式因其偶联过程中不损伤,且不阻碍抗体与抗原的识别位点等优势被广泛应用[27,28]。

麦芽为中医临床常用的中药材,具有行气消食、健脾开胃、退乳消肿[29]等功效。现代药理研究表明,麦芽还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抑制胆固醇与血脂增加、预防心血管疾病、增强免疫能力等作用[30]。麦芽还是粮食、饲料和酿酒的重要原料。麦芽的制备加工过程中[31],极易霉变变质产生真菌毒素如OTA等。所以,有必要建立适合麦芽中OTA的现场、灵敏、高效的检测方法[32,33]。

本研究建立了一种基于间接竞争模式的流式微球方法,在荧光微球表面偶联牛血清白蛋白(BSA)OTA复合物,与样品中OTA共同竞争特异性抗体,加入荧光标记的二抗探针后,通过流式细胞仪检测微球本体和表面荧光,实现OTA的定性定量测定。本方法操作简单、检测通量大、检出限低、灵敏度高、特异性好、受基质干扰小,可推广用于中药材等复杂基质中其它真菌毒素的分析和检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);液相色谱串联质谱系统: LC20AD XR液相色谱仪(日本岛津公司),5500 QTRAP质谱仪(美国AB SCIEX公司);TUS200P恒温振荡金属浴(上海一恒公司);KQ500超声仪(昆山市超声仪器有限公司);ANKE TGL16C高速离心机(上海安亭公司);AB135S电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);pH计(德国Sartorius公司)

羧基化红色荧光微球FC05F(Φ 4.95 μm,激发波长630 nm,发射波长690 nm)购自美国Bangs Laboratories公司;OTA对照品(浓度为1.0 mg/mL)购于新加坡Pribolab公司;牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)购自SigmaAldrich公司;OTA牛血清白蛋白(BSAOTA,7.8 mg/mL)、OTA单克隆抗体(mAb,7.2 mg/mL)购自山东绿都生物工程有限公司;异硫氰酸荧光素标记羊抗小鼠二抗(Fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled goat antimouse IgG(H+L),1.5 mg/mL)购自美国Fitzgerald公司;吗啉乙磺酸(MES)、N羟基琥珀酰亚胺盐酸盐(NHS)、碳化二亚胺(EDC)购自美国Sigma公司;其它试剂均为分析纯。

2.2 缓冲液的配制

10 mmol/L PBS(pH=7.4): NaCl 8.0 g、Na2HPO4 1.2 g、KH2PO4 0.2 g、KCl 0.2 g加蒸馏水溶解并定容至1000 mL;封闭液: PBSBT(pH 7.4,含1% BSA和0.1% Tween20);洗涤缓冲液: PBST(pH 7.4,含0.1% Tween20);保存缓冲液: PBSBTN(pH 7.4,含0.1 % BSA、0.01% Tween20和 0.05% NaN3);活化缓冲液: 50 mmol/L MES(pH 5.0);偶联缓冲液: 50 mmol/L MES(pH6.0);偶联剂: 0.32 mol/L EDC、 0.33 mol/L NHS;样品提取液: 甲醇PBS(60∶40, V/V);样品稀释液: 甲醇PBS(20∶80, V/V),均用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH调节pH值,溶液在使用前均用0.22 μm滤膜过滤。

2.3 羧基荧光微球偶联BSAOTA

根据Bangs laboratories(TechNote 205 Covalent Coupling)提供的方案制备微球偶联BSAOTA免疫分析物。取10 μL(约1.433×106个)荧光微球于2 mL离心管中,加入200 μL 活化缓冲液振荡30 s,充分混匀后静置5 min,14000 r/min离心15 min,弃上清液。微球用活化缓冲液清洗2次后,加入160 μL偶联缓冲液、20 μL EDC、20 μL NHS,于恒温振荡, 金属浴中孵育(25℃,600 r/min)30 min,14000 r/min离心15 min,弃去上清液;加入200 μL偶联缓冲液及BSAOTA蛋白偶联物,充分混匀后恒温振荡金属浴上孵育2 h,14000 r/min离心15 min,弃去上清液。微球清洗2次,加入500 μL封闭液,再于恒温振荡金属浴中孵育2 h。离心弃去上清液,偶联好的微球用缓冲液清洗2次,加入1 mL保存缓冲液于4℃储藏备用。分别取1, 2, 4, 8, 10, 20和30 μL偶联BSAOTA的微球,加入200 μL PBS混匀,流式细胞仪检测。偶联微球制备及检测过程,均在避光条件下进行。

2.4 样品及标准品溶液的制备

称取麦芽粗粉(过2号筛)1 g于10 mL 离心管中,加入2 mL样品提取液,涡旋混匀1 min,超声提取15 min,12000 r/min离心10 min,吸取上清液过0.22 μm聚四氟乙烯滤膜。滤液稀释5倍后,14000 r/min离心10 min,取上清液备用。

取适量1.0 mg/mL OTA甲醇储备液,加入阴性样品提取液,制备0, 0.001, 0.01, 0.098, 0.391, 1.56, 6.25, 25和100 ng/ mL的基质匹配OTA标准溶液。

2.5 样品中OTA的检测

取100 μL不同浓度的基质匹配标准品或样品溶液,加入100 μL 50 ng/mL抗体孵育20 min,加入10 μL偶联BSAOTA微球孵育40 min,离心去上清液;微球清洗2次,加入1∶4000倍稀释的FITCIgG荧光二抗孵育1 h,离心,用缓冲液清洗2次,加入200 μL PBS振荡混匀后用流式细胞仪检测。检测时,635 nm激光激发微球本体荧光,在流式细胞仪的APC荧光值通道检测;488 nm激光激发微球表面结合的FITCIgG荧光,在流式细胞仪的FITC荧光值通道检测。收集2000个微球的检测信号,约90 s后结束检测,每个样品平行制备3份检测样品进行平行检测,分析微球表面的平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI),对样品中OTA进行定量分析[33]。

2.6 数据分析

3.1.6 盐离子浓度的影响 考察了PBS溶液中的盐离子浓度(以HPO2-4和H2PO-4计)对检测结果的影响。由图1e可见,随着PBS溶液中盐离子浓度的增加,微球表面的荧光值逐渐增强,当盐离子浓度为0.01 mol/L时达到最大;随盐离子浓度继续升高,荧光强度降低;当盐离子浓度为0.1 mol/L时,微球表面的荧光值几乎为0,说明此时抗体已经变性或者高浓度的盐致使微球变形、溶解。最终确定最适盐离子浓度为0.01 mol/L。

3.1.7 甲醇浓度的影响 麦芽样品经60%甲醇/PBS溶剂提取,但60%甲醇浓度易使抗体变性失活,样品提取液需经稀释后才能用于流式微球免疫分析。由图1f可见,随着甲醇浓度的升高,微球表面的荧光强度逐渐增强,当甲醇浓度达到30%时,微球表面荧光值最强;随着甲醇浓度的继续增加,荧光强度急剧降低。考虑到提取溶液中甲醇的存在,最终选择20%甲醇PBS对样品提取液和标准品溶液进行稀释,然后进样分析。

3.1.8 基质成分对流式微球免疫分析的影响

如图1g所示,样品基质液稀释倍数越多,基质成分对微球表面的荧光值影响越小。但稀释倍数越大,达不到方法的灵敏度和检出限要求。因此选择样品提取液稀释5倍后,进行检测以及基质加标实验。

3.2 非特异性吸附的考察

在流式细胞仪检测过程中,流式编码荧光微球在鞘液流中分布不均一发生粘连或非特异性吸附,均会影响流式细胞仪对微球表面荧光强度的检测。微球在APC通道的荧光峰出现峰高钝化或者肩峰,表明微球发生粘连,在溶液中分布不均一;在FITC通道的荧光峰出现峰形低、峰位变宽、峰形分叉,表明微球表面存在非特异性吸附。实验表明, 微球表面的平均荧光强度与背景干扰荧光值相当,

图2 缓冲液和麦芽样品提取液的竞争抑制校正曲线(n=3)

Fig.2 Calibration curves for inhibition immunoassay in buffer and malt extract (n=3)说明偶联BSAOTA微球表面的非特异性吸附量很少。

3.3 竞争抑制曲线的建立

标准品经样品稀释液或基质稀释液稀释成不同浓度后在优化的条件下进行检测,绘制竞争抑制曲线,计算方法的检出限、线性范围(IC10~IC90)及IC50值。由图2和表2可以看出,样品稀释液与基质稀释液对间接竞争的流式微球分析法影响较小,麦芽基质液对微球、抗体及微球表面的荧光强度淬灭少,对方法的灵敏度影响小。但抗原抗体之间的免疫反应受诸多实验因素的影响,因此选用基质校正曲线作为测定麦芽中OTA的标准竞争抑制曲线, 以减少误差。

3.6 麦芽实际样品中OTA的检测

采用建立的间接竞争模式的流式微球分析方法检测16批不同地点购买的麦芽样品中OTA的含量。在2批样品中检测到OTA,阳性样品发生率为12.5%,但OTA的含量(3.36和3.83 μg/kg)均未超出欧盟联合委员会(European Commission)对OTA的限量标准(5 μg/kg)。同时采用液相色谱串联质谱对上述样品进行检测,采用OTA离子对m/z 404.2→358及m/z 404.2→239.1及保留时间来对阳性样品进行确证, 两种方法检测结果一致。上述结果证明建立的流式微球技术可用于复杂基质麦芽样品中OTA的定性与定量分析,并可拓展用于其它复杂基质中更多真菌毒素的快速、灵敏检测。

4 结 论

建立了简单、快速、灵敏、准确的定性定量分析麦芽中OTA的间接竞争流式微球分析方法,考察了FITCIgG稀释倍数、孵育时间、温度、pH值、基质效应等条件对检测结果的影响,优化了反应条件。流式微球技术以羧基化荧光编码微球为载体,具有体积小、比表面积大、高扩散性、粒径及形态均一、荧光强度高的特点,检测灵敏度高,但聚苯乙烯微球比重轻,不易沉降,离心时微球易损失,清洗及离心过程耗时长,不利于快速检测。可以利用羧基荧光磁性微球,借助磁性分离,以减少微球损失,节约时间,且洗涤充分,以提高方法的灵敏度。基于间接竞争模式的流式微球分析检测技术,检测通量大、检出限低、分析速度快,适于中药复杂基质体系中痕量小分子物质的检测。麦芽样品只需60%甲醇/PBS简单提取、5倍稀释并孵育后即可上样检测,不需要额外的前处理步骤,提高了样品的提取效率,减少了样品处理过程中待测目标物真菌毒素的损失,对实际麦芽样品的检测结果与LCMS/MS检测结果一致。本研究运用流式微球技术快速检测麦芽中的OTA,为中药材质量监控提供了科学、有效的分析手段。

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