李 芳，邓子牛，赵 亚，李大志，戴素明

（湖南农业大学园艺园林学院/国家柑橘改良中心长沙分中心，长沙 410128）

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

李 芳，邓子牛，赵 亚，李大志，戴素明

（湖南农业大学园艺园林学院/国家柑橘改良中心长沙分中心，长沙 410128）

【目的】构建柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）含p23的RNAi载体，以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性，根据NCBI公布的CTV基因组序列，查找p23保守序列，设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体pBI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片，利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型，利用酶联免疫反应（ELISA）检测病毒含量。同时，提取叶片的RNA并反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR（q-PCR）检测CTV p20，通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段，抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA，通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性；目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗；根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物，检测转基因植株中p23的表达情况。取 CTV T36基因型寄主的带皮芽，用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片，用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。……