吕燕宁 李洁 卢桂兰 杜轶威 陈丽娟 窦相峰 孙瑛 黎新宇 庞星火 王全意

100013 北京市疾病预防控制中心传染病与地方病控制所 北京预防医学研究中心



·论著·

不同类型样本对黄热病实验室检测的意义

吕燕宁 李洁 卢桂兰 杜轶威 陈丽娟 窦相峰 孙瑛 黎新宇 庞星火 王全意

100013 北京市疾病预防控制中心传染病与地方病控制所 北京预防医学研究中心

目的 探讨不同类型的样本对黄热病实验室检测的意义。方法 采用实时荧光RT-PCR法检测5例黄热病病例不同时间采集的不同类型样本中黄热病毒的核酸。结果 5例病例中，1例患者在病程≤6 d时采集的样本中，仅在血清中检测到病毒核酸；另外4例患者在病程≥6 d时采集的样本中，仅在尿液中检测到病毒核酸。结论 黄热病感染早期，病毒核酸检测为快速灵敏的实验室检测方法，血清样本为病毒核酸检测的适宜临床样本，随着病程的推移，尿液样本逐渐成为病毒核酸检测的适宜临床样本。

黄热病是由黄热病毒引起的蚊媒传染病，是一种以发热、黄疸、蛋白尿、相对缓脉和出血等为主要临床特征的急性传染病，在非洲和南美洲的热带地区呈地方性流行。有33个国家约4．5亿人处在黄热病感染危险中[1]，据世界卫生组织(WHO)估计，现在每年全球约有20万黄热病病例，死亡6万例，病死率高达20%-50%，严重威胁人类健康。随着全球经济发展，国际间人际交往的频繁，使黄热病的传播加速，其疫区不断扩大，黄热病疫情进入非黄热病流行区的风险日益增加，不仅成为地区性的严重公共卫生问题，而且也是全球性的严重威胁。黄热病是WHO，也是我国《国境卫生检疫法》规定的国境卫生检疫三大传染病之一。因此，及时发现病例对预防和控制该病的传播和流行具有重要意义。

本研究报道了北京市5例输入性黄热病病例不同时间、不同类型的样本的实验室检测过程与结果，探讨不同时间、不同类型样本的检测意义，对提高该类病例的检测能力、及时发现可疑病例、防止该病传入我国具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 患者样本 2016年3月11日至2016年4月11日，共收集北京市5例黄热病输入病例的临床样本(表1)，包括非抗凝全血、唾液、咽拭子、尿液等，于4 ℃条件下运输至北京市疾病预防控制中心实验室进行检测。

1.2 样本处理与保存 实验室收到全血样本后，4 ℃、4 000rpm、5min离心分离血清，将血清进行分装，唾液、咽拭子和尿液也进行分装，除了即时用于实验室检测的样本外，均于-80 ℃保存。

1.3 核酸提取 血清、唾液、尿液与咽拭子样本均取140μl，采用Qiagen公司生产的试剂盒QIAampViralRNAKit(52906)提取病毒RNA。

1.4 实时荧光RT-PCR检测 黄热病毒核酸检测采用生科源技术有限公司生产的试剂盒(SKY-8612)。仪器采用LightCycler480II实时荧光PCR仪，反应条件及结果判断参照试剂盒说明书进行。结果以LightCycler480II软件(版本1.5.0)分析。样本结果判定：阳性样本检测结果Ct值≤30，有明显指数增长；可疑样本检测结果Ct值在30-35范围，此时应对样本进行重复检测，如果重复实验结果Ct值仍在30-35范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。阴性样本检测结果Ct值>35或无Ct值。

表1 5例病例的基本信息及不同样本的检测结果

1.5 测序 将阳性扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行克隆测序。序列通过NCBI的BLAST进行DNA序列比对。

2 结果

2.1 病例基本信息和不同病程、不同类型样本的检测结果 5例病例采样时间距发病时间最长者为13天，最短为2天。除第一例病例在血清中检测到病毒核酸外，其余4例病例均只在尿液中检测到黄热病毒核酸，其中第5例病例曾于11个月前接种过黄热病疫苗(表1)。

注：Gambia 2001-AY572535.1为黄热病毒Gambia 2001株(GenBank: AY572535.1)，以此类推，每个序列以毒株名称及其GenBank收录号命名， positive control为本实验所用试剂盒中阳性对照的扩增产物序列，BJYF01-BJYF05为本研究中5个病例样本中的黄热病毒序列。图1 5例病例样本扩增序列进化树分析Note: Grambia 2001-AY572535.1 is yellow fever virus Grambia 2001 Strain(GenBank:AY572535.1).Equally, every sequence was named as strain name and its Genbank No., positive control is the sequence of positive control in the kit. BJYF01-BJYF05 are sequences from 5 cases in this studyFig.1 Phylogenotic tree analysis of the amplified sequences from 5 cases’ samples

2.2 5例病例扩增产物的序列测定与比对结果 将5例病例的扩增产物进行克隆测序，得到88个碱基的序列，在NCBI网站进行BLAST，结果显示5例病例扩增产物的序列均与黄热病毒Angola71株相匹配，相似度为95%。而试剂盒的阳性对照扩增产物为86 bp的核酸片段，序列与黄热病毒疫苗株17D、17D-204、17D/Tiantan、YF/Vaccine/USA/Sanofi-Pasteur-17D-204/UF795AA/YFVax等相匹配，相似度为100%。扩增序列进化树分析见图1。

3 讨论

黄热病是由黄热病毒引起经埃及伊蚊、南美洲Haemogogus蚊和少数伊蚊属蚊种等传播的一种病死率高、危害性较大的传染病。人对该病毒普遍敏感，不分年龄、性别和种族。本病一般呈散发，如果媒介蚊虫大量繁殖，感染能在人群中引起暴发流行，危害极大。我国不是黄热病的流行区，既往也从未发现黄热病的传入，随着我国改革开放以及对外交流的增多，自2016年3月起我国陆续从非洲黄热病流行区安哥拉经多个口岸输入了多起黄热病病例，因此，黄热病的检疫和快速敏感的实验室检测对严防病例输入显得至关重要。

黄热病的实验室检测方法主要有病毒分离、血清特异性IgM/IgG抗体检测、病毒抗原以及黄热病毒RNA检测等，疑似病例的任一实验室检测结果阳性均可以确诊[2,3]。而常规的黄热病毒培养对实验室的要求较高，需要在生物安全三级实验室(BSL-3)内进行，且操作复杂、费时。抗原检测的灵敏度不高，抗体检测与其他黄病毒有明显的交叉反应，这给血清学诊断带来了一定的困难。PCR方法以其快速、灵敏、特异性强等优点在黄病毒属病毒的快速检测和鉴别方面有着广泛的应用[4]。

由于国内之前从未有过黄热病确诊病例的出现，因此对于此类病例的病毒核酸检测样本的采集时机以及需要采集的样本类型缺乏了解。有资料推荐采集全血、血清、脑脊液、腹腔液或胸腔液以及肝组织活检等[5]，但各种样本采集的难易程度、患者的可接受程度以及检测的敏感性均不同，对于诊断的意义也不同。如何在最佳时机采集最佳样本是关系到能否对病例进行迅速准确的诊断，并将对患者的损害降到最低。对此查阅国内外文献鲜有论述，仅有的研究报道为接种黄热病疫苗后，健康者和出现疫苗相关副反应者尿液中能够检测到疫苗株病毒核酸，可持续到20多天，甚至可达198 d[5，6]。国内外关于同属病毒，如登革和寨卡病毒的适宜检测样本类型研究较多，研究发现这些病毒感染后可在患者唾液、尿液中检测到病毒核酸[7-12]，但对于黄热病未能查到相关的研究和报道。

我国往从未有本地或输入性黄热病病例的报道[13]。随着我国与非洲、南美等黄热病流行区交流的增多，北京市于2016年3月11日发现中国首例黄热病输入病例[14-16]，截至4月11日一个月的时间内又陆续发现4例输入病例。我们对这有限的5例病例尝试采集了不同类型的样本，观察了在不同病程时间、不同样本对黄热病毒核酸检测的意义。由于首例患者入院后即出现了严重的肾功能衰竭，采取了透析治疗，未能及时采集到患者的尿液样本，其余患者均采集到了血液、唾液和尿液样本。

由于样本量有限以及现有试剂的局限性，不能对所有样本进行多次重复检测，仅在初次检测时进行了重复实验，也不能对样本中病毒核酸的拷贝数进行精确定量，仅能根据Ct值来进行评估和讨论。因此本次研究采取了严格的实验室质控，每次核酸提取均采用相同的样本量、相同的提取流程，并设提取对照。每次实时荧光RT-PCR反应均设阴性及阳性对照。每个病例同次采集的样本均作了重复实验。将不同时间采集的不同样本采用相同的实验过程和条件进行检测，尽量去除其他因素的影响以保证实验结果的可比性。检测阳性的样本均采用二代测序技术进行了序列测定，并获得了病毒的全基因组序列(结果尚未发表)。

研究结果显示，不同时间采集的血清样本中，病毒核酸量随病程进展而降低。黄热病典型临床过程可分为病毒血症期、缓解期、肝肾损伤期和恢复期。其中病毒血症期可持续3-5 d，可以在患者血液中检测到病毒核酸。在我们观察的5例病例中，只有首例病例由于病情较重，并最终在发病9 d时死亡，因此病毒血症期持续存在，在发病6 d时采集的样本中仍然可以检测到病毒核酸。其他病例在病程≥6 d时采集的血清样本中均未检测到病毒核酸。

不同类型样本中，5例患者有4例采集到唾液样本，除首例病例唾液样本病毒核酸检测值处于灰区外，其他3例患者的唾液检测均为阴性，因此从这几例病例的检测实践来看，唾液并不适合作为黄热病急性期的指示样本来采集。5例病例中，有2例采集了咽拭子，但也均未检出病毒核酸。5例病例中有4例采集到了尿液样本，病毒核酸检测均为阳性，这4例患者的病程≥6 d，血清检测均为阴性。

综合上述结果，血清和尿液可作为黄热病毒核酸检测的有效样本。血清适宜在发病早期采集，发病超过5-6 d后尿液的检测对病例诊断更有意义。而唾液样本的检测敏感性很低，不适宜采用。

扩增产物的序列测定与比对显示5例病例样本扩增子的序列均与黄热病毒Angola71株的序列相匹配，而试剂盒阳性对照扩增子序列则与黄热病毒的17D、17D-204、17D/Tiantan等多种疫苗株的序列100%匹配，因此我们目前采用的试剂盒不能区分黄热病疫苗株和野毒株Angola71，而Angola71是目前疫区的流行株。由于部分人群接种黄热疫苗后会出现不良反应[17]，而且接种者尿液中能够检测到疫苗株病毒核酸[6]，因此，对于近期由安哥拉疫区输入的疑似病例，采用本试剂盒进行检测时一定要询问患者的疫苗接种史，了解其是否接种了疫苗、接种了多长时间等，以便对实验结果做出正确解释和判断，必要时要采用测序方法进行确证。本研究中的第5例患者，在11个月前接种过黄热病疫苗，但测序结果显示此次发病是由于感染了疫区的野毒株所致。

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Significance of different types of samples for the laboratory detection of yellow fever

LyuYanning,LiJie,LuGuilan,DuYiwei,ChenLijuan,DouXiangfeng,SunYing,LiXinyu,PangXinghuo,WangQuanyi

InstituteofInfectiousandEndemicDiseasesControl,BeijingCenterforDiseasesControlandPrevention,BeijingCenterforPreventiveMedicine,Beijing100013,China

WangQuanyi,Email:bjcdcxm@126.com

ObjectiveToinvestigatethesignificanceofdifferenttypesamplesforthelaboratorydetectionofyellowfever.MethodsDifferenttypesofsampleswerecollectedatdifferenttimefrom5yellowfevercases,andtheyellowfevervirusRNAwasdetectedbyreal-timePCR.ResultsForthe5casesamongthesamplescollectedin≥6daysfromtheonset,onlytheserumsamplefrom1patientwaspositiveandtheurinesamplesfromtheother4patientswerepositive.ConclusionsIntheearlyphaseofyellowfever,theviralRNAdetectionisafastandsensitivelaboratorytestmethod,andserumistheappropriateclinicsamplefortheviralRNAdetection.Withthelapseoftime,urinebecomestheappropriateclinicsamplefortheviralRNAdetection.

Yellowfever；Laboratorydetection；ViralRNA；Sample

王全意，Email: bjcdcxm@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.007

黄热病；实验室检测；病毒核酸；样本

2016-06-04)