谷雅君 佘钿田 付红伟 秦伟 王毅超 刘运德

300203 天津医科大学医学检验学院(谷雅君、佘钿田、付红伟、王毅超、刘运德);300052 天津医科大学总医院检验中心(付红伟)，普通外科(秦伟)



·综述·

FDA紧急使用授权的埃博拉检测技术的评估比较

谷雅君 佘钿田 付红伟 秦伟 王毅超 刘运德

300203 天津医科大学医学检验学院(谷雅君、佘钿田、付红伟、王毅超、刘运德);300052 天津医科大学总医院检验中心(付红伟)，普通外科(秦伟)

埃博拉病毒 (Ebolavirus, EBOV) 是引起人类及其他哺乳动物埃博拉出血热的病原体，由于死亡率高达70%-90%，疾病的早期诊断与及时治疗显得尤为重要。迄今为止，FDA授权了11项紧急使用的EBOV检测方法，主要分为依赖rRT-PCR的病毒核酸检测和基于抗原抗体反应的病毒抗原检测两大类；其中前者是实验室检测EBOV感染最敏感的方法，主要包括EZ1、NP、VP40、NGDS BT-E、Biothreat-E、RealStar、LightMix以及Cepheid Xpert试验；而基于病毒抗原的检测，如Corgenix ReEBOV和OraQuick更加快速且无需依赖任何特殊仪器设备，适用于床旁和现场检测。如何建立适用于多种标本类型的检测方法，更加快速特异地进行检测分型，将是未来发展EBOV检测平台的重要发展方向。

Fund programs: Tianjin City High School Science & Technology Fund Planning Project (20140124); Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (15JCQNJC11600;15JCYBJC27400)

埃博拉病毒 (Ebolavirus, EBOV) 属丝状病毒科丝状病毒属、单股负链RNA病毒，无细胞结构，主要由RNA和衣壳蛋白组成，呈长丝状体。病毒基因组被包裹在完全封闭的核衣壳外壳中，长约18.9 kb，主要编码七种蛋白质 (图1)：包膜刺突糖蛋白 (glycoprotein, GP)、核蛋白 (nucleoprotein, NP)、复制转录蛋白VP30、聚合酶辅助因子VP35、基质蛋白VP40、基质蛋白VP24和 RNA依赖性RNA 聚合酶L组成[1-4]。

图1 埃博拉病毒的基因组结构示意图Fig.1 Genome structure of Ebola virus

EBOV是一种能够引起人类和灵长类动物产生急性出血热传染病的病原体，主要通过接触受感染的动物或人的血液和体液进行传播。1976年，EBOV疫情首次暴发于非洲刚果民主共和国 (前扎伊尔)，至今无治疗特效药，被列为生物安全第四等级病毒 (Biosafety Level 4，BSL 4)[5]，甚至高于HIV和SARS (BSL 3)。2014年，几内亚、利比里亚、塞拉利昂等非洲国家出现了EBOV疫情大暴发。据WHO报告，截止2016年3月16日，以上三个主要疫情国家共报告出现28 603例确诊或疑似埃博拉出血热病例[6]，因此如何建立简便、快速的实验室诊断方法是控制疫情传播的重要手段。美国食品药品管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 授权了数项埃紧急使用的博拉病毒检测方法 (表1)，这些方法主要分为依赖实时逆转录聚合酶链反应 (real-time reverse transcriptase PCR, rRT-PCR) 的病毒核酸检测和基于抗原抗体反应的病毒抗原检测两大类。

1 基于PCR的检测技术

自2014年以来，美国FDA已紧急批准了八项 PCR相关技术用于EBOV的检测，分别是来源于美国国防部 (The U.S. Department of Defense, DoD) EZ1试验、 美国疾病控制与预防中心 (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) NP和VP40试验、BioFire Defense公司FilmArray NGDS BT-E 和Biothreat-E试验、AltonaDiagostics公司RealStarFilov-irus 筛查试剂盒、罗氏公司的LightMix试验以及Cepheid AB公司的Xpert试验。虽然各方法商品化名称各异，但该类方法工作原理和实验流程大致相同。提取患者全血、血清、血浆或体液中的总RNA后，针对高度保守的NP或GP等编码基因设计引物，结合逆转录和实时PCR即rRT-qPCR的方法在发病一周内即可检测到病毒核酸。迄今为止，rRT-qPCR是实验室检测EBOV感染最敏感的技术。

Leski等[7]采用FilmArray Biothreat-E test在83例疑似EBOV感染患者的血液、咽拭子或尿液标本中，检测到6例阳性患者，且与CDC推荐的Ebola Virus NP Real-time RT-PCR Assay和 VP40 Real-time RT-PCR Assay阳性结果完全一致。配合FilmArray定制的快速、高精准、易于操作的PCR分子诊断仪，FilmArray Biothreat-E test可在1 h内完成并提交EBOV检测报告。Southern等[8]评估了FDA紧急授权的4种EBOV病毒检测方法，包括CDC的NP 和 VP40Real-time RT-PCR Assay和生物梅里埃旗下BioFire公司的FilmArrayBiothreat-E test和BT-E panel。对于阴性对照和4×107至4×102TCID50/ml 间各滴度的人工掺入EBOV的全血标本，FilmArray和rRT-PCR检出结果完全一致。而对于感染患者的临床标本，FilmArray和rRT-PCR检测全血和尿液的一致性均为85% (23/27, 11/13)。当使用Filmarray检测全血，而rRT-PCR检测配对血浆时，其一致性达90%。FilmArray为那些缺乏大型PCR仪器的医疗机构和公共卫生实验室开辟了一种新的EBOV检测途径。

虽然rRT-qPCR技术有着灵敏度高、特异性强、简便快速等优势，但仍存在着一定的局限性[9]。第一，PCR 操作过程中的交叉污染可能会造成假阳性和非特异性扩增，影响检测结果的准确性和可靠性。第二，rRT-qPCR技术需要特殊仪器进行核酸扩增，不适用于床旁和现场检测。第三，尽管大多PCR方法基于EBOV基因组保守区NP或GP序列进行扩增，但病毒基因序列仍存在高度突变[10]，常规引物可能出现不同程度的漏检。Gire等[11]利用高通量组技术对2014年疫情暴发的78个患者的99个EBOV基因组进行测序，与以往有记录的EBOV相比，出现 341个固定碱基替换与 55 个单核苷酸多态性位点，提示了宿主内和宿主间病毒基因组呈现一定程度的多态性。因此，如何针对所有可致病性亚型的EBOV对现有PCR方法进行完善是科研人员的重要任务。

2 病毒抗原检测技术

FDA紧急批准的三项EBOV抗原快速检测技术，分别是来源于Corgenix公司的ReEBOV Antigen Rapid Test和OraSure公司的两项OraQuick Ebola Rapid Antigen Test。

美国Corgenix公司所开发的新型EBOV抗原快速检测工具和早孕测试笔的工作原理相似，可以通过试纸条上的颜色变化，快速判断出病毒的存在。如果待检血液中含有EBOV，那么在检测条上会有明显的颜色变化显示。Broadhurst等[12]收集了来源于塞拉利昂多家临床医学中心的连续EDTA静脉血样本进行EBOV抗原快速检测 (ReEBOV Antigen Rapid Test)和实时RT-PCR (RealStar Filovirus RT-PCR Kit, AltonaDiagostics) 检测。在45份RT-PCR阳性的样本中，快速检测结果全部为阳性 (灵敏度100%，95% CI 92.1-100)；RT-PCR检验结果为阴性的232例样本中，214份样品快检结果为阴性 (特异度92.2%，95% CI 88.0-95.3)。ReEBOV快检试剂仅需一滴血即可进行床旁检测，该法在减少样本体积的同时，降低了检验人员的感染风险，缩短了疑似病例需要隔离的等待时间[13]。与ReEBOV Antigen Rapid Test相似，OraSure Technologies公司研发的OraQuick也是基于抗原抗体反应的试纸条技术，其检测时间短于rRT-PCR相关技术，操作步骤简便易行。但快速诊断试剂盒敏感性有待提高，以期能够在早期疫情爆发时检测出EBOV[14]。

表1 已获得FDA紧急使用授权的埃博拉病毒检测方法 [15](按照获批先后时间排序)

注：PFU, plaque-forming uint, 空斑形成单位;TCID, Tissue culture infective dose,半数组织培养感染剂量; Rxn, reaction, 反应)

[1] Jun SR, Leuze MR, Nookaew I, et al.Ebolavirus comparative genomics [J]. FEMS Microbiol Rev, 2015, 39(5):764-778. doi: 10.1093/femsre/fuv031.

[2] Licata JM, Johnson RF, Han Z, et al.Contribution of ebola virus glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 virus-like particles [J].J Virol, 2004, 78(14): 7344-7351. doi: 10.1128/JVI.78.14.7344-7351.2004.

[3] 秦恩强. 埃博拉病毒病的研究进展 [J]. 中华现代护理杂志, 2014, 20(35): 4409-4410. doi:10.3760/j.issn.1674-2907.2014.35.001.

[4] 孙玉兰，李德新. 埃博拉病毒结构蛋白研究进展 [J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2004, 18(4): 392-394. doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2004.04.033.

[5] Watt A, Moukambi F, Banadyga L, et al. A novel life cycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 in virus infectivity [J]. J Virol, 2014, 88(18):10511-10524. doi: 10.1128/JVI.01272-14.

[6] World Health Organization. Ebola situationreport-16 MARCH 2016 (http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/204629/1/ebolasitrep_16Mar2016_eng.pdf?ua=1&ua=1).

[7] Leski TA, Ansumana R, Taitt CR, et al. Use of the FilmArray System for Detection of Zaire ebolavirus in a Small Hospital in Bo, Sierra Leone [J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(7): 2368-2370. doi: 10.1128/JCM.00527-15.

[8] Southern TR, Racsa LD, Albario CG, et al. Comparison of FilmArray and Quantitative Real-Time Reverse Transcriptase PCR for Detection of Zaire Ebolavirus from Contrived and Clinical Specimens [J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(9): 2956-2960. doi: 10.1128/JCM.01317-15.

[9] 马硝惟，李敏. 埃博拉病毒的实验室检测[J]. 中华临床实验室管理电子杂志，2014, 2(3): 148-151.

[10] Park DJ, Dudas G, Wohl S, et al. Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone [J].Cell, 2015, 161(7): 1516-1526. doi: 10.1016/j.cell.2015.06.007.

[11] Gire SK, Goba A, Andersen KG, et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak [J]. Science, 2014, 345(6202): 1369-1372. doi: 10.1126/science.1259657.

[12] Broadhurst MJ, Kelly JD, Miller A, et al. ReEBOV Antigen Rapid Test kit for point-of-care and laboratory-based testing for Ebola virus disease: a field validation study [J]. Lancet, 2015, 386(9996): 867-874. doi: 10.1016/S0140-6736(15)61042-X.

[13] 刘玮，房彤宇，曹务春. 埃博拉病毒病主要研究进展及援非实验室检测 [J]. 中华流行病学杂志, 2015, 36(9): 1023-1025. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.09.026.

[14] Su S, Wong G, Qiu X, et al. Diagnostic strategies for Ebola virus detection [J].Lancet Infect Dis, 2016, 16(3): 294-295. doi: 10.1016/S1473-3099(16)00049-9.

[15] http://www.fda.gov/emergencypreparedness/counterterrorism/medicalcountermeasures/mcmlegalregulatoryandpolicyframework/ucm182568.htm

Emergency use authorization for Ebola virus detection by FDA-approved techniques

GuYajun,SheTiantian,FuHongwei,QinWei,WangYichao,LiuYunde

SchoolofMedicalLaboratory,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300203,China(GuYJ,SheTT,FuHW,WangYC,LiuYD);LaboratoryCenter,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China(FuHW)，DepartmentofGeneralSurgery,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China(QinW)

LiuYunde,Email:yundeliu@126.com

Ebola virus (EBOV) is an aggressive pathogen that causes a highly hemorrhagic fever syndrome in humans and other mammalian species. Early detection and proper treatment is the best defense against EBOV because of high mortality rate (70%-90%). Currently, there are eleven FDA approved Ebola tests, kits, or assays for emergency use, which can be divided into two main categories: rRT-PCR and viral antigen methods. In BSL 4 lab, rRT-PCR is the most sensitive technique to detect nucleic acid of Ebola virus, including Ebola Zaire (EZ1) rRT-PCR (TaqMan) Assay, Ebola Virus NP and VP40 Real-time RT-PCR Assay,FilmArray NGDS BT-E and Biothreat-E test, RealStar Ebolavirus RT-PCR kit, LightMix Ebola Zaire rRT-PCR test, and Xpert Ebola Assay. Antigen-based technology (ReEBOV Antigen Rapid Test, and OraQuick Ebola Rapid Antigen Test) provides rapid Ebola antigen test without relying on special PCR equipment. How to develop, manufacture, and market point-of-care and field testing will be the next major challenge for EBOV on various samples.

FDA; emergency use authorization; Ebola; nucleic acid; antigen

刘运德，Email：yundeliu@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.020

美国食品药品管理局；紧急使用授权；埃博拉；核酸；抗原

天津市高等学校科技发展基金计划项目(20140124);天津市应用基础与前沿技术研究计划(15JCQNJC11600;15JCYBJC27400)

2016-04-28)